楊梅葉提取物抑菌活性初步研究

李 橋，楊小豐，張紹勇，張 旭，陳安良

(1.浙江林學(xué)院 林業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，浙江 臨安 311300;2.浙江省湖州市新農(nóng)村建設(shè)研究中心，浙江 湖州 313000)

植物源農(nóng)藥作為生物農(nóng)藥的一部分，其開發(fā)研究一直是新農(nóng)藥研究的熱點(diǎn)課題之一［1］。楊梅(Myrica rubra)屬楊梅科、楊梅屬果樹，多年生常綠喬木，為我國(guó)特產(chǎn)。楊梅葉是可以快速生長(zhǎng)的再生資源，資源豐富。對(duì)楊梅葉的研究目前主要集中在2個(gè)方面:一是對(duì)其中化學(xué)成分的研究［2－6］;二是楊梅葉提取物的抑菌活性研究。胡靜麗［7］測(cè)定了楊梅葉乙醇提取物對(duì)食品常見污染菌的抑制效果，結(jié)果顯示，對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草桿菌革蘭氏陽(yáng)性菌以及對(duì)食品中常見腐敗菌如橘青霉、圓弧青霉和黑曲霉效果較好。陳蓉蓉等［8］用矮楊梅葉水煎物作了抑菌試驗(yàn)，結(jié)果表明，對(duì)G+金黃色葡萄球菌有抑制作用。沈建國(guó)等［9］用楊梅葉提取物進(jìn)行了抗煙草花葉病毒的研究，結(jié)果表明，具有較強(qiáng)的體外鈍化和抗病毒侵染作用。夏其樂等［10］研究了楊梅葉提取物的抗氧化活性，結(jié)果顯示，具有很強(qiáng)的抗氧化活性。劉洪波等［11］采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定了楊梅葉粗提物對(duì)6種常見植物病原菌的抑制活性，結(jié)果表明，楊梅葉丙酮提取物對(duì)常見植物病原菌有較高的抑制作用。我們采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定楊梅葉甲醇浸膏的石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇4個(gè)萃取相對(duì)農(nóng)業(yè)上常見的植物病害病原菌的抑菌作用，旨在為尋找楊梅葉中抑菌活性物質(zhì)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用楊梅葉，2008年7月采于浙江林學(xué)院校園內(nèi)，室溫下自然風(fēng)干，粉碎，過40目篩 (孔徑0.37 mm)，密封，置于冰箱中 (0～4℃)備用。

1.2 植物病原菌

植物病原菌，番茄灰霉病菌 (Botrytis cinerea)，番茄早疫病菌 (Altemaria solani)，水稻紋枯病菌 (Rhizoctoniasolani)，小麥赤霉病菌(Fusaiumgraminearum)，黃瓜炭疽病菌(Colletotrichumlagenarium)，玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica)，均由浙江林學(xué)院森林保護(hù)實(shí)驗(yàn)室提供。

化學(xué)試劑，甲醇、石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇均為分析純。

1.3 提取

取1.1節(jié)所得樣品2 kg，在室溫下用甲醇浸提3次，浸提時(shí)間分別為24，24，48 h，每次浸提后再超聲提取45 min，合并提取液，減壓濃縮得浸膏356.85 g。將浸膏300.00 g加去離子水800 mL混勻得懸濁液，分別用等量的石油醚 (60～90℃)、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取，每種溶劑萃取3次，濃縮至膏狀，得石油醚相19.93 g、氯仿相14.81乙酸乙酯相18.46 g、正丁醇相28.26 g。

1.4 抑菌活性測(cè)定

1.4.1 不同溶劑萃取相毒力測(cè)定方法

采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定楊梅葉各萃取相對(duì)供試植物病原菌的抑制作用。將各萃取相用丙酮溶解，再配制含各萃取相質(zhì)量濃度10 g·L－1的PDA培養(yǎng)基，倒入直徑為9 cm的培養(yǎng)皿中，對(duì)照為丙酮。每處理設(shè)4個(gè)重復(fù)，向上述各培養(yǎng)基中接入生長(zhǎng)旺盛的直徑為5 mm的病原菌菌餅，每皿1塊。將接好菌的培養(yǎng)基用保鮮膜密封，置于25℃條件下培養(yǎng)，待空白對(duì)照菌絲長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿后，采用十字交叉法測(cè)量各自的菌落直徑。菌絲生長(zhǎng)抑制率計(jì)算公式:抑制率 (%)=(對(duì)照菌落直徑 －處理菌落直徑) ×100/對(duì)照菌落直徑。菌落直徑 (cm)=測(cè)量菌落直徑平均值－0.5。0.5為菌餅直徑。

1.4.2 乙酸乙酯、正丁醇萃取相精密毒力測(cè)定

測(cè)定方法同1.4.1節(jié)，用丙酮溶解楊梅葉乙酸乙酯和正丁醇萃取相，再配制不同濃度的培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中各萃取相濃度為 1，5，10，20 g·L－1，供試菌為玉米大斑病、番茄灰霉病、水稻紋枯病、小麥赤霉病等4種。

2 結(jié)果與分析

2.1 萃取相對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用

楊梅葉不同溶劑萃取相對(duì)供試植物病原菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用見表1。在10 g· L－1濃度下，各萃取相之間對(duì)多數(shù)供試病原菌抑菌作用差異較大。其中乙酸乙酯相總體抑菌效果最好，其對(duì)番茄早疫病菌、水稻紋枯病菌、小麥赤霉病菌和黃瓜炭疽病菌的抑制效果均為最好，抑制率依次為62.61%，73.33%，59.44%和49.31%;正丁醇相抑制效果次之，其對(duì)番茄灰霉病菌和玉米大斑病菌的抑制率最高，抑制率分別為81.52%和72.12;石油醚相的抑菌作用最差。

表1 不同溶劑萃取相對(duì)供試植物病原菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用

2.2 乙酸乙酯、正丁醇萃取相對(duì)病原菌的毒力

表2、3可見。楊梅葉乙酸乙酯萃取相對(duì)4種供試病原菌的毒力差異不大，EC50最大值與最小值之間的差值為3.21 g·L－1。乙酸乙酯萃取物對(duì)水稻紋枯病的毒力最強(qiáng)，EC50為2.21 g·L－1，對(duì)玉米大斑病菌的毒力次之，EC50為3.32 g·L－1;對(duì)小麥赤霉病菌的毒力最弱，EC50為5.42 g·L－1。

表2 楊梅葉乙酸乙酯萃取相對(duì)供試病原菌的毒力

表3 楊梅葉正丁醇萃取相對(duì)供試病原菌的毒力

楊梅葉正丁醇萃取相對(duì)番茄灰霉病菌的毒力最強(qiáng)，EC50為0.88 g·L－1;對(duì)玉米大斑病菌的毒力次之，EC50為1.92 g·L－1;對(duì)小麥赤霉病菌的毒力最弱，EC50為 9.22 g·L－1。

3 小結(jié)和討論

楊梅葉中含有多種黃酮類化合物［2］，黃酮類化合物具有廣泛生物活性［12］，而乙酸乙酯可以萃取出黃酮類化合物，因此本試驗(yàn)中乙酸乙酯對(duì)各種供試菌的活性很可能是其中黃酮類化合物的抑菌作用。此外，正丁醇相也具有良好的抑菌作用，說明楊梅葉中除黃酮類化合物之外還有其它類型抑菌活性物質(zhì)，值得進(jìn)一步研究。

本試驗(yàn)只研究了楊梅葉乙酸乙酯萃取相、正丁醇萃取相對(duì)供試菌的菌絲生長(zhǎng)速率的抑制活性，并且只對(duì)幾種供試菌種的毒力進(jìn)行了測(cè)試，尚未進(jìn)行盆裁藥效試驗(yàn)。下一步將進(jìn)行活體和室外試驗(yàn)，并擴(kuò)大供試菌種范圍，以確定楊梅葉提取物的殺菌譜，為以后的防治工作提供參考。

［1］喬康，姬小雪.植物源殺菌劑研究進(jìn)展［J］.農(nóng)藥研究與應(yīng)用，2009，13(4):15－20.

［2］鄒耀洪，李桂榮.反相高效液相色譜分析楊梅葉中抗氧化成分黃酮類化合物［J］.分析化學(xué)，1998，26(5):531－534.

［3］鐘瑞敏，張振明，王羽梅，等.楊梅樹葉、皮、根部精油成分及其抗氧化活性物質(zhì)［J］.林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè)，2006，26(1):1－5.

［4］周志宏，楊崇仁.矮楊梅鮮葉的酚性化學(xué)成分［J］.云南植物研究，2000，22(2):219－224.

［5］劉寧，李正芬，林鐵，等.矮楊梅葉精油化學(xué)成分分析［J］.貴州師范大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，1996，14(2):1－4.

［6］劉寧，李正芬，林鐵，等.矮楊梅根皮，莖皮，葉蹂質(zhì)含量的測(cè)定［J］.貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，1995，17(4):64－67.

［7］胡靜麗.楊梅葉提取物抑菌作用的研究［D］.杭州:浙江大學(xué)，2003.

［8］陳蓉蓉，劉寧.貴州民族藥楊梅葉抗菌作用的實(shí)驗(yàn)研究［J］.貴州師范大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，1999，17(3):30－32.

［9］沈建國(guó)，謝荔巖，翟梅枝，等.楊梅葉提取物抗煙草花葉病毒活性及其化學(xué)成分初步研究［J］.福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2004，33(4):441－443.

［10］夏其樂，陳健初，吳丹.楊梅葉提取物抗氧化活性的研究［J］.食品科學(xué)，2004，25(8):80－82.

［11］劉洪波，史東輝，陳安良，等.楊梅葉提取物對(duì)6種常見植物病原菌的抑制活性［J］.浙江林學(xué)院學(xué)報(bào)，2009，26(1):95－99.

［12］張紀(jì)寧，楊潔.黃酮類化合物的生物活性研究進(jìn)展［J］.伊犁師范學(xué)院學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2009，6(2):29－31.