整合酶及細(xì)胞輔助因子LEDGF與慢病毒整合

郝飛飛，田晉紅，周建華

(1.西南大學(xué)藥學(xué)院，重慶 400716；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所，黑龍江哈爾濱 150001）

整合酶及細(xì)胞輔助因子LEDGF與慢病毒整合

郝飛飛1，2，田晉紅1，周建華2*

(1.西南大學(xué)藥學(xué)院，重慶 400716；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所，黑龍江哈爾濱 150001）

慢病毒屬逆轉(zhuǎn)錄病毒科，包括人免疫缺陷病毒(HIV-1和HIV-2）、猴免疫缺陷病毒(SIV）、馬傳染性貧血病毒(EIAV）、牛免疫缺陷病毒(BIV）、貓免疫缺陷病毒(FIV）、綿羊梅迪-維斯納病毒(MVV）和山羊關(guān)節(jié)炎-腦炎病毒(CAEV）。其中EIAV是人類最早發(fā)現(xiàn)的慢病毒[1]。這些慢病毒成員在形態(tài)、基因組結(jié)構(gòu)、細(xì)胞嗜性、病毒的生活周期、病毒復(fù)制的分子機(jī)制，尤其是病毒的整合機(jī)制等方面相似。近些年來，由于HIV-1對(duì)人類健康的危害，慢病毒復(fù)制的各個(gè)環(huán)節(jié)倍受關(guān)注，期望找出能夠控制HIV-1復(fù)制的靶點(diǎn)，抑制其在體內(nèi)的復(fù)制。慢病毒基因組整合至宿主染色體和基因的高度易變性使得慢病毒的治療和疫苗研發(fā)異常困難。因此，整合酶是慢病毒研究熱點(diǎn)之一。

1 整合酶的結(jié)構(gòu)與功能

慢病毒的整合酶具有3個(gè)相同的保守結(jié)構(gòu)域。以的HIV-1的整合酶為例，由病毒pol基因末端編碼的288個(gè)氨基酸組成，包含3個(gè)不同結(jié)構(gòu)和功能的結(jié)構(gòu)域，即N端結(jié)構(gòu)域(N terminal domain，NTD）、催化核心區(qū)結(jié)構(gòu)域(Catalytic core domain，CCD）和 C端結(jié)構(gòu)域(C terminal domain，CTD）。每個(gè)結(jié)構(gòu)域直接或間接地促進(jìn)整合酶和DNA的整合[2]。

1.1 整合酶的結(jié)構(gòu) 以HIV-1為例，該酶的NTD包括1 aa～46 aa，通過一個(gè)接頭片段(47 aa～55 aa）與CCD連接。NTD具有一個(gè)在所有慢病毒的整合酶和逆轉(zhuǎn)錄過程中都保守的HTH基序，包括兩對(duì)保守氨基酸殘基-組氨酸殘基12和16以及半胱氨酸殘基40和43[3-4]，該基序可以和Zn2+結(jié)合形成鋅指結(jié)構(gòu)并且促進(jìn)整合酶的功能性寡聚化[5-6]。與Zn2+結(jié)合的殘基突變會(huì)促使整合酶單體的產(chǎn)生并且抑制3'端加工和鏈轉(zhuǎn)移反應(yīng)[7]。此外，最近生物化學(xué)和結(jié)構(gòu)生物學(xué)的研究表明，NTD和CCD的相互作用會(huì)發(fā)生在整合酶的功能性四聚化中。若將NTD和CCD相互作用表面的14位丙氨酸替換成賴氨酸，則使整合酶四聚體變得不穩(wěn)定，并降低整合酶的催化活性[8-9]。

CCD是整合酶的催化活性中心，是多聚核苷酸轉(zhuǎn)移酶超級(jí)家族的成員之一，與細(xì)菌的核糖核酸酶H有共同的骨架和相似的催化機(jī)制[10]。CCD的催化位點(diǎn)是由保守的3個(gè)氨基酸殘基-天冬氨酸殘基64和116，谷氨酸殘基152組成，主要作用是與二價(jià)金屬離子結(jié)合，對(duì)整合酶的催化起到輔助作用[11-12]。體外突變和細(xì)胞內(nèi)突變這些氨基酸殘基會(huì)嚴(yán)重降低內(nèi)整合酶的活性[7-13]。實(shí)驗(yàn)證明，Mg2+和Mn2+對(duì)酶與DNA底物的反應(yīng)是必要的，由于Mg2+在細(xì)胞內(nèi)的相對(duì)濃度較高，被認(rèn)為是生理學(xué)輔助因子。整合酶利用相同的催化位點(diǎn)催化3'端加工和鏈轉(zhuǎn)移反應(yīng)[14]。因此，CCD很可能是結(jié)合病毒和靶DNA的結(jié)合位點(diǎn)。對(duì)HIV整合酶的晶體結(jié)構(gòu)解析發(fā)現(xiàn)，CCD由6個(gè)α螺旋和5個(gè)β片層組成，包括3個(gè)保守的氨基酸殘基形成一個(gè)D，DX35E基序[14]，可以與金屬離子直接結(jié)合。突變其中的氨基酸殘基，會(huì)嚴(yán)重地降低酶的功能[32]。

HIV-1的CTD結(jié)構(gòu)域富含堿性氨基酸殘基，由5個(gè)β片層組成，屬于類SH3結(jié)構(gòu)域[15]，而通常具有相似折疊的蛋白會(huì)以非特異性方式結(jié)合到DNA的小溝處[16-17]。CTD是整合酶3個(gè)結(jié)構(gòu)域中最為不保守的區(qū)域，被認(rèn)為是與DNA底物結(jié)合的區(qū)域。實(shí)驗(yàn)證明，C末端241位和242位的亮氨酸殘基突變?yōu)楸彼釟埢鶗?huì)影響整合酶二聚體的形成，從而減弱整合酶的催化活性[18]。

1.2 整合酶的功能 慢病毒侵染宿主并融合入細(xì)胞(圖1A），經(jīng)脫殼后，病毒RNA在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，并與整合酶一起完成3'端加工(3'processing）和鏈轉(zhuǎn)移(Strand transfer）反應(yīng)這2個(gè)過程，將病毒的DNA整合入宿主基因組中(圖1B）。

1.2.1 3'端加工作用首先，整合酶以二聚體的方式與病毒的長(zhǎng)末端重復(fù)序列(LTR）結(jié)合[2]。LTR包含了一個(gè)保守的CAGT序列，整合酶通過水解磷酸二酯鍵分別切下堿基GT，從而露出堿基CA，形成了可與染色體DNA相匹配的交錯(cuò)切口[19]。此后，連接在cDNA兩端的2個(gè)整合酶二聚體形成四聚體，在胞漿中與宿主因子形成整合前復(fù)合物(Pre-integration complex，PIC）。這個(gè)過程稱為3'端加工。

1.2.2 鏈轉(zhuǎn)移反應(yīng)在3'端加工之后，PIC進(jìn)入細(xì)胞核，整合酶交錯(cuò)切割宿主細(xì)胞染色體DNA，產(chǎn)生間隔5個(gè)堿基的交錯(cuò)切口，然后病毒DNA的3'端帶自由羥基的堿基與宿主DNA的5'端共價(jià)連接，并由細(xì)胞的DNA修復(fù)酶將病毒DNA 5'末端與宿主DNA 3'末端補(bǔ)齊，完成整合過程[19]。

圖1 慢病毒侵染細(xì)胞過程和逆轉(zhuǎn)錄后DNA的整合機(jī)制

2 LEDGF/p75的主要結(jié)構(gòu)

LEDGF與已發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄協(xié)同激活因子p75為同一種蛋白，因此也稱為L(zhǎng)EDGF/p75。LEDGF是普遍存在于細(xì)胞核內(nèi)的蛋白，在細(xì)胞周期過程中與染色體關(guān)系緊密[20-21]。LEDGF主要通過一個(gè)位于C末端的小的α螺旋結(jié)構(gòu)域-整合酶結(jié)合結(jié)構(gòu)域(Integrase-binding domain，IBD）與慢病毒的整合酶相互作用。除了IBD結(jié)構(gòu)域以外，全長(zhǎng)LEDGF蛋白還包含其它結(jié)構(gòu)和功能性部分：N端的PWWP結(jié)構(gòu)域，可以介導(dǎo)蛋白質(zhì)-DNA和蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用；核定位信號(hào)區(qū)(Nuclear-localization signal，NLS），主要決定LEDGF的核定向轉(zhuǎn)運(yùn)，參與LEDGF與整合酶的鏈合作用；AT-鉤基序，易于和富含AT堿基的DNA小溝狀結(jié)構(gòu)結(jié)合，輔助PWWP將LEDGF鏈合在宿主DNA特定序列；極性氨基酸區(qū)域(Charged region,CR1-3）[22-23]。

3 LEDGF調(diào)節(jié)整合酶-DNA的相互作用

LEDGF是一個(gè)重要的慢病毒整合酶配體，可以調(diào)節(jié)慢病毒在被感染細(xì)胞中的整合反應(yīng)[24]。這種細(xì)胞內(nèi)源性蛋白在結(jié)構(gòu)上具有雙重功能：其C末端包含的整合酶結(jié)合結(jié)構(gòu)域IBD，其作用是與整合酶結(jié)合，而N端部分則是將PIC鏈接至宿主染色體。LEDGF可以與整合酶相互作用形成復(fù)合體，從而使整合酶免于體內(nèi)蛋白酶的降解[8-9，25]。LEDGF對(duì)整合酶與染色體的作用也有一定的輔助作用，可以促進(jìn)病毒整合的進(jìn)行。體外純化LEDGF蛋白并以DNA為底物模擬其相互作用，可檢測(cè)到LEDGF具有較強(qiáng)的調(diào)節(jié)鏈轉(zhuǎn)移反應(yīng)活性。實(shí)驗(yàn)是以一個(gè)短鏈DNA為底物，以一個(gè)環(huán)狀質(zhì)粒為靶目標(biāo)，LEDGF既可有效地提高半位點(diǎn)(Half site）整合反應(yīng)，即只能激發(fā)單一短鏈DNA一端的整合，又可以調(diào)節(jié)全位點(diǎn)(Full site）整合反應(yīng)，即2個(gè)短鏈DNA一端整合到目標(biāo)質(zhì)粒上。然而，當(dāng)用長(zhǎng)鏈DNA替換短鏈DNA，LEDGF只能有效地提高半位點(diǎn)的整合反應(yīng)。但目前還不了解為什么對(duì)于不同長(zhǎng)度的DNA片段會(huì)有不同的整合結(jié)果。另外一個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)將適量的LEDGF加入經(jīng)14℃，15 min預(yù)孵育的整合酶-DNA復(fù)合物中，可以有效的激發(fā)整合反應(yīng)。然而，若先將LEDGF與整合酶預(yù)先孵育，再加入病毒DNA，結(jié)果半位點(diǎn)的整合反應(yīng)顯著增加[25]。

4 整合酶的四聚化以及LEDGF在其中的作用

LEDGF可以通過穩(wěn)定整合酶亞單位與亞單位之間的相互作用調(diào)節(jié)整合酶的結(jié)構(gòu)，并且促進(jìn)整合酶的四聚化[8]。實(shí)驗(yàn)證明，整合酶的四聚化對(duì)于LEDGF的高親和性結(jié)合非常重要。一個(gè)穩(wěn)定的整合酶四聚體可以有效地保證催化3'端加工和鏈轉(zhuǎn)移反應(yīng)中酶的活性。當(dāng)溶液中存在整合酶的單體、二聚體、四聚體以及其他的聚合形式時(shí)，IBD會(huì)強(qiáng)烈的促使整合酶形成四聚體，并且激發(fā)整合酶的催化功能。位點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)證明，賴氨酸殘基14、186和188對(duì)整合酶四聚體的形成和與LEDGF的高親和性結(jié)合上起到非常重要的作用。此外，若將賴氨酸殘基14、186和精氨酸殘基187突變?yōu)楸彼幔瑒t會(huì)明顯降低整合酶在3'加工和鏈轉(zhuǎn)移反應(yīng)中的活性[25]。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，四聚體的形成對(duì)于整合酶與DNA底物的相互作用，以及與LEDGF的結(jié)合都非常重要。用蛋白質(zhì)印記實(shí)驗(yàn)分析整合酶與DNA的復(fù)合物時(shí)發(fā)現(xiàn)，賴氨酸殘基14在與DNA結(jié)合上起到一定作用。整合酶賴氨酸殘基14對(duì)于其二聚體-二聚體的作用以及整合酶與宿主DNA和LEDGF的結(jié)合都非常重要[26]。另一些實(shí)驗(yàn)提示，賴氨酸殘基14，186和精氨酸殘基187確實(shí)在病毒感染過程中起著重要作用。賴氨酸殘基188突變?yōu)楸彼釀t會(huì)導(dǎo)致病毒的細(xì)胞感染水平下降，但并不會(huì)影響病毒的感染與傳播[27]。根據(jù)這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果推測(cè)，功能性四聚體的形成可以使整合酶保持四個(gè)與LEDGF高親和性位點(diǎn)。這樣，一個(gè)LEDGF分子就可以有效地將PIC鏈合到宿主染色體上。所以，整合酶四聚體是一種重要的生物學(xué)形式，在發(fā)揮其催化活性和與LEDGF的高親和性上都起到不可或缺的作用。

5 LEDGF對(duì)整合酶活性的影響

IBD被認(rèn)為是LEDGF直接與整合酶相互作用的區(qū)域。雖然IBD也可以穩(wěn)定整合酶的四聚體，并且激發(fā)3'端加工反應(yīng)[25]，但卻沒有充分的證據(jù)證明該區(qū)域能夠促進(jìn)鏈轉(zhuǎn)移反應(yīng)的進(jìn)行[28]。IBD基因敲除后的LEDGF，能競(jìng)爭(zhēng)性抑制LEDGF依賴的HIV-1整合酶鏈轉(zhuǎn)移反應(yīng)[28]，若過量表達(dá)GFP的IBD也會(huì)抑制HIV-1在人體內(nèi)的整合[29]。Turlure等人[22]用裸露的DNA為靶目標(biāo)進(jìn)行的研究表明，LEDGF的226 aa～530 aa氨基酸殘基所具有的刺激鏈轉(zhuǎn)移反應(yīng)活性約為全長(zhǎng)LEDGF的50%。另外，激發(fā)EIAV整合酶的鏈轉(zhuǎn)移反應(yīng)需要LEDGF結(jié)構(gòu)中AT-鉤基序的存在。相似的實(shí)驗(yàn)采用重構(gòu)的多聚核小體作為靶目標(biāo)，結(jié)果顯示在HIV-1整合到染色體DNA過程中，需要N端的PWWP結(jié)構(gòu)域的參與[30]。Meehan等人[31]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，將IBD與異源性染色體結(jié)合會(huì)產(chǎn)生功能性輔助因子，能夠使HIV-1在缺少LEDGF的細(xì)胞內(nèi)整合反應(yīng)正常進(jìn)行。因此，LEDGF對(duì)慢病毒整合酶的影響包括提高生物學(xué)相關(guān)的多聚化，從而特異性的促進(jìn)鏈反應(yīng)和鏈合PIC到靶DNA。此外，目前還不能排除LEDGF對(duì)整合酶活性位點(diǎn)有變構(gòu)調(diào)節(jié)功能。

6 目前研究存在的問題和展望

多項(xiàng)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)證明，LEDGF蛋白通過其IBD結(jié)構(gòu)域?qū)φ厦复呋诵膮^(qū)進(jìn)行特異性識(shí)別，將整合酶鏈合到宿主染色體的特定區(qū)域，從而介導(dǎo)慢病毒整合酶對(duì)宿主染色體特異位點(diǎn)的結(jié)合。因此，LEDGF是保持慢病毒復(fù)制及感染性所必需的輔助因子。雖然LEDGF蛋白的IBD結(jié)構(gòu)域與整合酶催化核心區(qū)復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)已被解析，但是對(duì)于LEDGF在細(xì)胞中天然特性方面的了解還是空白，甚至LEDGF在細(xì)胞染色體內(nèi)在分配還未見報(bào)道。新近發(fā)現(xiàn)的一些其他與LEDGF結(jié)合的配體會(huì)在某些情況下利用其鏈合作用整合到染色體上，這將有助于進(jìn)一步了解其天然的功能。

HIV的整合反應(yīng)為抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物的開發(fā)提供了重要的靶點(diǎn)，抑制整合酶-LEDGF的相互作用被廣泛認(rèn)為可以用來開發(fā)新型藥物。在結(jié)構(gòu)生物學(xué)方面，LEDGF已經(jīng)被認(rèn)為是研究逆轉(zhuǎn)錄病毒DNA整合反應(yīng)非常有用的工具。我們期望通過進(jìn)一步對(duì)LEDGF的結(jié)構(gòu)以及LEDGF與慢病毒整合酶共同形成的復(fù)合體結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析，為整合酶抑制劑的開發(fā)提供支持。

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(本文編輯：趙曉巖）