雞白痢沙門氏菌CVCC578標(biāo)準(zhǔn)株VBNC研究模型的建立及鑒定

李 影，段 銳，孫曉媛，錢愛東，王偉利

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林長春 130118；2.吉林省遼源市畜牧總站，吉林遼源 136200；3.吉林出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，吉林長春 130062）

雞白痢沙門氏菌CVCC578標(biāo)準(zhǔn)株VBNC研究模型的建立及鑒定

李 影1*，段 銳2，孫曉媛1，錢愛東1，王偉利3

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林長春 130118；2.吉林省遼源市畜牧總站，吉林遼源 136200；3.吉林出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，吉林長春 130062）

為建立活的非可培養(yǎng)狀態(tài)(VBNC）研究模型，本研究利用液體LB和4℃聯(lián)合條件對(duì)雞白痢沙門氏菌CVCC578參考株的進(jìn)行VBNC誘導(dǎo)，構(gòu)建VBNC研究模型。同時(shí)依靠胎牛血清和程序性升溫對(duì)處于該狀態(tài)的菌體進(jìn)行復(fù)蘇，并對(duì)復(fù)蘇前后的細(xì)菌進(jìn)行了16S rRNA驗(yàn)證。結(jié)果表明：實(shí)驗(yàn)菌株經(jīng)液體LB和4℃聯(lián)合誘導(dǎo)后，可培養(yǎng)菌數(shù)在55 d后降至零，總菌數(shù)在整個(gè)觀察期內(nèi)基本不變，而活菌數(shù)在150 d后開始下降，180 d后下降顯著，表明實(shí)驗(yàn)菌株可在55 d進(jìn)入VBNC，而且維持時(shí)間至180 d。當(dāng)進(jìn)入該狀態(tài)后，菌體形態(tài)可由桿狀變?yōu)榍驐U或球形，并且菌體排列可由單在變?yōu)榫奂?。?jīng)復(fù)蘇和16S rRNA鑒定后，“變態(tài)”的細(xì)菌被證實(shí)為沙門氏菌，而非雜污染菌。該實(shí)驗(yàn)為規(guī)范VBNC沙門氏菌的鑒定程序以及制訂相應(yīng)的國家檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

雞白痢沙門氏菌；活的非可培養(yǎng)狀態(tài)；復(fù)蘇；16S rRNA

沙門氏菌是腸桿菌科中引起人類和動(dòng)物發(fā)病及食物中毒的主要病原菌之一。據(jù)世界衛(wèi)生組織的報(bào)告，1985年以來在世界范圍內(nèi)由沙門氏菌引起的已確診的人類患病人數(shù)顯著增加，在一些歐洲國家已增加五倍以上。在我國內(nèi)陸地區(qū)，由沙門氏菌引起的食物中毒屢居首位[1]。食物中毒的主要來源是肉類食品，其中含有豐富的營養(yǎng)成分，適于沙門氏菌的繁殖，攝入后在沙門氏菌毒素的作用下發(fā)生食物中毒[2]。

目前，我國質(zhì)檢系統(tǒng)在細(xì)菌檢測(cè)方面仍采用傳統(tǒng)的細(xì)菌培養(yǎng)方法，這種方法只能檢測(cè)出在培養(yǎng)基上可生長的細(xì)菌。然而對(duì)于一些進(jìn)入了“活的非可培養(yǎng)狀態(tài)”(Viable but non-culturable，VBNC）的細(xì)菌而言，無論是采用傳統(tǒng)的培養(yǎng)技術(shù)或敏感性高的PCR技術(shù)及基因芯片技術(shù)也很難檢測(cè)到，并且極易被認(rèn)定是“死”菌。盡管細(xì)菌在不良環(huán)境中進(jìn)入VBNC后，仍保持了致病性，但喪失了在培養(yǎng)基中生長的能力，成為“隱性”傳染源[3]。因此，一旦沙門氏菌進(jìn)入VBNC，以現(xiàn)行檢測(cè)方法往往會(huì)造成漏檢。然而，一定條件下VBNC菌的復(fù)蘇，即恢復(fù)到可培養(yǎng)狀態(tài)，可再次造成暴發(fā)性流行。為此，本研究以雞白痢沙門氏菌為研究對(duì)象，通過建立和驗(yàn)證VBNC研究模型，旨在為進(jìn)一步建立針對(duì)VBNC沙門氏菌的檢測(cè)方法和制訂相應(yīng)的國家檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)打下提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)菌株 雞白痢沙門氏菌CVCC578參考株，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.2 主要試劑 SS瓊脂購自日本榮研化學(xué)株式會(huì)社，LIVE/DEADRBaclightTMBacterial Viability Kit(13152）購自Probes MoLecuLar公司，大豆蛋白胨和酵母粉購自英國Oxoid公司，標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清、細(xì)菌總DNA提取試劑盒、PCR試劑均購自TaKaRa公司，DNA回收純化試劑盒購自BioFlux公司等。

1.3 菌株培養(yǎng) 將實(shí)驗(yàn)菌株接種至含50 mL LB液體培養(yǎng)基的中，37℃，200 r/min，通氣振蕩培養(yǎng)過夜，當(dāng)OD600nm接近0.7時(shí)終止培養(yǎng)。

1.4 VBNC狀態(tài)誘導(dǎo) 取1 mL菌液至無菌離心管中，6 000 r/min離心5 min，棄上清，用滅菌生理鹽水洗菌體2次，接入100 mL的LB液體培養(yǎng)基中，將細(xì)菌數(shù)調(diào)整菌數(shù)至108CFU/mL。然后將菌在4℃和需氧條件下培養(yǎng)。同時(shí)每隔5 d取平板計(jì)數(shù)，檢查可培養(yǎng)菌數(shù)變化，同時(shí)按文獻(xiàn)[4]進(jìn)行熒光顯微鏡觀察確定沙門氏菌的“活與死”，以及形態(tài)等變化情況，設(shè)立正常培養(yǎng)菌作為對(duì)照。

1.5 可培養(yǎng)菌數(shù)測(cè)定 取菌液1 mL，6 000 r/min，離心5 min，棄上清，用滅菌生理鹽水洗菌體2次后，進(jìn)行10倍系列稀釋，取100 μL適當(dāng)稀釋度的菌液涂于SS平板上，37℃培養(yǎng)，次日觀察計(jì)數(shù)菌落。當(dāng)平板無菌落生長時(shí)，續(xù)續(xù)培養(yǎng)3 d，若仍無菌落出現(xiàn)，則菌落數(shù)計(jì)為1。

1.6 總菌數(shù)與活菌數(shù)測(cè)定 利用LIVE/DEAD試劑盒中的SYTO9和PI分別測(cè)定呈現(xiàn)綠色熒的活菌和呈現(xiàn)紅色熒光的死菌，總菌數(shù)即為活菌與死菌之和。當(dāng)可培養(yǎng)菌數(shù)降至零時(shí)，尚需每隔20 d～30 d測(cè)定總菌數(shù)與活菌數(shù)，具體操作參見文獻(xiàn)[5]。

1.7 VBNC細(xì)菌復(fù)蘇鑒定 取 VBNC菌 1 mL，6 000 r/min離心5 min，棄上清，用滅菌生理鹽水清洗菌體沉淀2次，菌體沉淀用滅菌雙蒸水100 μL溶解。加入200 μL的無菌胎牛血清，混勻，將其置于熱程控循環(huán)儀孔內(nèi)，按15℃，20 min～30 min 25℃，1 h～1.5 h 37℃，1 h～1.5 h程序?qū)?xì)菌進(jìn)行孵育。其后，將菌液倒入SS液體培養(yǎng)基中，并放入氣浴振蕩搖床內(nèi)，220 r/min，有氧培養(yǎng)，每隔1 h取樣進(jìn)行平板計(jì)數(shù)。同時(shí)設(shè)只添加胎牛血清且不含VBNC細(xì)菌液的SS培養(yǎng)基為對(duì)照。

1.8 16S rRNA鑒定 采用已發(fā)表的沙門氏菌通用引物[6-7]即 27-F：5'-AGAGTTTGATCMTGGCTC-3'和1492-R： 5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'， 其 PCR擴(kuò)增片段約為1 500 bp。利用細(xì)菌總DNA提取試劑盒分別提取正常培養(yǎng)條件、VBNC狀態(tài)及復(fù)蘇后的細(xì)菌總DNA，具體操作按說明書進(jìn)行。在PCR反應(yīng)體系中依次加入 10×PCR Buffer 2 μL，dNTP Mixture(各2.5 mM）2 μL，上下游引物均為10 pmoL，ExTaq酶2.5 U，模板DNA 2 μL，最后用滅菌雙蒸水補(bǔ)至50 μL，每次反應(yīng)均設(shè)水為空白對(duì)照。按94℃8 min；94℃ 40 s、58℃1 min、72℃，90 s；30個(gè)循環(huán)，72℃10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并用BioFlux公司的Biospin膠回收試劑盒回收。PCR產(chǎn)物由TaKaRa公司測(cè)序，應(yīng)用在線Blast進(jìn)行比對(duì)驗(yàn)證。

2 結(jié) 果

2.1 菌數(shù)測(cè)定結(jié)果 實(shí)驗(yàn)菌株的可培養(yǎng)菌數(shù)在培養(yǎng)25 d后可培養(yǎng)菌數(shù)急劇下降，同時(shí)到了35 d時(shí)下降較緩和，55 d后可培養(yǎng)數(shù)降為零。而測(cè)得總菌數(shù)和活菌數(shù)在55 d內(nèi)隨時(shí)間基本保持不變，說明確實(shí)存在無培養(yǎng)能力的活菌，表明實(shí)驗(yàn)菌株在55 d時(shí)進(jìn)入了VBNC。由圖1可知，盡管在186 d內(nèi)總菌數(shù)仍基本不變，但活菌數(shù)卻已經(jīng)下降了105倍，特別是在180 d后，活菌數(shù)開始顯著下降，這表明在55 d至180 d期間，實(shí)驗(yàn)菌株一直處于VBNC狀態(tài)，即VBNC維持時(shí)間不超過125 d。

2.2 VBNC沙門氏菌熒光觀察結(jié)果 實(shí)驗(yàn)菌株在正常狀態(tài)下多為短小桿菌，并完全呈現(xiàn)綠色熒光(圖2-1）。當(dāng)可培養(yǎng)菌數(shù)降為零時(shí)(55 d），多數(shù)細(xì)菌菌體形態(tài)發(fā)生了變化，即由短桿變?yōu)榍驐U形，有的甚至為球形，同時(shí)還觀察到個(gè)別呈現(xiàn)紅色熒光的死菌(圖2-2）。然而在VBNC維持期內(nèi)(55 d～180 d）菌體的交聯(lián)度明顯增強(qiáng)，出現(xiàn)了“鏈桿菌”(圖2-3）。并且在180 d后，紅色死菌也明顯增多，結(jié)合菌數(shù)測(cè)定結(jié)果可知，實(shí)驗(yàn)菌株在180 d后開始由VBNC狀態(tài)轉(zhuǎn)入真正的死亡期。

2.3 VBNC沙門氏菌復(fù)蘇結(jié)果 選擇55 d～180 d的VBNC菌液進(jìn)行復(fù)蘇。結(jié)果表明：55 d、85 d和100 d時(shí)的細(xì)菌能得到有效復(fù)蘇，分別在4 h、6 h和6 h時(shí)可培養(yǎng)菌數(shù)突然顯著增長，而且復(fù)蘇的細(xì)菌數(shù)接近誘導(dǎo)前水平。由此表明，實(shí)驗(yàn)菌株在LB和4℃聯(lián)合誘導(dǎo)可進(jìn)入VBNC，在胎牛血清及程序升溫條件下可重新恢復(fù)為可培養(yǎng)狀態(tài)。但隨著誘導(dǎo)時(shí)間延長，具有復(fù)蘇能力的細(xì)菌逐漸減少，120 d后的VBNC細(xì)菌卻無法實(shí)現(xiàn)復(fù)蘇(表1）。

表1 VBNC沙門氏菌復(fù)蘇結(jié)果Table 1 The resuscitation ofSalmonellafrom VBNC

2.4 16S rRNA基因PCR擴(kuò)增結(jié)果 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠電泳上呈單一條帶，約為1 500 bp，與預(yù)期大小相符(圖3）。

2.5 序列分析結(jié)果 將經(jīng)過PCR檢測(cè)的產(chǎn)物直接測(cè)序(序列略），利用在線 Align two(or more）sequences using BLAST(bl2seq）功能分別比較了VBNC與正常，復(fù)蘇后與正常，VBNC與復(fù)蘇后等3種情況。經(jīng)分析，這3種情況的核苷酸同源性分別為98%、97%和97%。由于16S rRNA序列的同源性大于97%的便可認(rèn)為是同一種菌[8]，故而證實(shí)了實(shí)驗(yàn)菌株在VBNC誘導(dǎo)與復(fù)蘇過程中，在形態(tài)及排列方面所反映出的變化實(shí)為同一種細(xì)菌所呈現(xiàn)的，而非雜菌污染。

3 討論

目前，被多數(shù)人接受和承認(rèn)的判定細(xì)菌是否進(jìn)入VBNC的依據(jù)仍源自于許懷恕等人于1982年提出的VBNC概念，即指細(xì)菌在不良環(huán)境中，細(xì)胞縮成球形，用常規(guī)方法(平板法、最大可能近似值法）培養(yǎng)時(shí)，不能生長繁殖，但仍然是活的一種特殊存在形式，在適宜條件下可恢復(fù)為可培養(yǎng)狀態(tài)[9]。現(xiàn)將VBNC判定程序歸納如下：首先在可培養(yǎng)數(shù)為零前提下，總菌數(shù)要基本不變，活菌數(shù)可以有所變化，但不能顯著或急劇下降。其次，進(jìn)入VBNC后，菌體可在形態(tài)、體積、排列、蛋白質(zhì)組成等某些或其它方面所有變化。再次，細(xì)菌可在正常與VBNC狀態(tài)間自行轉(zhuǎn)變，即應(yīng)找到適合的誘導(dǎo)因素和適宜的復(fù)蘇條件。最后，為消除雜菌污染等質(zhì)疑，需利用分子生物學(xué)技術(shù)，如探針、16S rRNA等加以確定。在研究過程中，實(shí)驗(yàn)菌株在55 d時(shí)形態(tài)就已經(jīng)發(fā)生改變，而且在VBNC維持期內(nèi)細(xì)菌的聚集程度也逐漸增加，出現(xiàn)了一些“鏈桿菌”。因而為消除細(xì)菌因形態(tài)及排列變化所帶來的質(zhì)疑，本實(shí)驗(yàn)除提取55 d時(shí)VBNC菌的總DNA外，還隨機(jī)選取了87 d、118 d和155 d時(shí)的VBNC菌DNA，16S rRNA方法所擴(kuò)增的實(shí)為處于不同時(shí)期VBNC菌的DNA的混合物。

綜合以上考慮，本研究在LB和4℃聯(lián)合誘導(dǎo)55 d后，成功建立了雞白痢沙門氏菌CVCC578參考株的VBNC研究模型。該模型完全符合細(xì)菌VBNC的定義，同時(shí)也具備如下生物學(xué)特點(diǎn)和意義。特點(diǎn)：1.喪失了在平板上生長繁殖能力，但經(jīng)胎牛血清與程序性升溫共同作用后可重新恢復(fù)可培養(yǎng)能力。2.模型中細(xì)菌形態(tài)發(fā)生變化(桿狀變?yōu)榍驐U或球形），但經(jīng)復(fù)蘇和16S RNA鑒定，“變態(tài)”的細(xì)菌證實(shí)為沙門氏菌，而非雜菌污染。3.進(jìn)入VBNC時(shí)間為55 d，維持時(shí)間為125 d，但復(fù)蘇較好時(shí)機(jī)應(yīng)選120 d前。意義：1.為VBNC細(xì)菌鑒定提供了值得參與和借鑒的研究程序和依據(jù)，使VBNC細(xì)菌的認(rèn)定更加規(guī)范和具體。2.以沙門氏菌參考株用為研究對(duì)象，為制訂和建立針對(duì)食源性沙門氏菌檢測(cè)的國家標(biāo)準(zhǔn)做好前期研究工作。

[1]黃文宇，柳陳堅(jiān).食源性沙門氏菌檢測(cè)方法的研究進(jìn)展[J].生物技術(shù)，2009，19(3）：95-98.

[2]王洪霞，張代濤，李志峰，等.湯卜遜沙門菌暴發(fā)分離株的鑒定及與丙型副傷寒沙門菌的鑒別[J].中國人獸共患病學(xué)報(bào)，2009，25(4）：348-351.

[3]李影，王偉利，錢愛東.畜產(chǎn)中相關(guān)食源性致病菌“活的非可培養(yǎng)狀態(tài)”的檢測(cè)策略[J].中國動(dòng)物檢疫，2009，26(1）：46-47.

[4]孫曉媛，錢愛東，李影.三株沙門氏菌VBNC狀態(tài)誘導(dǎo)條件的篩選[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2009，31(1）：193-197.

[5]李影，魏忠彬，錢愛東，等.低濃度冰醋酸誘導(dǎo)的雞源大腸桿菌活的非可培養(yǎng)狀態(tài)的研究[J].中國獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2007，27(5）：645-648.

[6]Corby-Harris V,Pontaroli A C.Geographical distribution and diversity ofbacteria associated with natural populations of Drosophila melanogaster[J].Appl Environ Microbiol,2007,73:3470-3479.

[7]李可，鄭天凌，田蘊(yùn)，等.南美白對(duì)蝦腸道微生物群落的分子分析[J].微生物學(xué)報(bào)，2007，47(4）：649-653.

[8]李永峰，任南琪，楊傳平，等.16S rDNA測(cè)序快速鑒定廢水生物處理系統(tǒng)目標(biāo)細(xì)菌[J].哈爾濱工程大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，26(6）：806-810.

[9]Xu H S,Roberts N,Singleton F L,et al.Survival and viability of nonculmmblcE.coiland Vibrio cholerar in the estuarine and marine environment[J].Microb Ecol,1982,8(4）:313-323.

Establishment of a model for viable but non-culturable withSalmonella pullorumCVCC578 standard strain

LI Ying1*,DUAN Rui2,SUN Xiao-yuan1,QIAN Ai-dong1,WANG Wei-li3

(1.College of Animal Science Jilin Agriculture University,Changchun 130118,China;2.Liaoyuan Animal Husbandry Stationary,Liaoyuan 136200,China;3.Jilin EntryExit Inspection and Quarantine Bureau,Changchun 130062,China）

In this study,the viable but non-culturable(VBNC）Salmonella pullorumCVCC578 standard strain was induced in LB medium at 4℃in order to establish a model for VBNC bacteria identificaction and detection.VBNCSalmonella pullorumwas resuscitated with fetal bovine serum and gradient incubated temperatures,and resuscitation and non-resuscitation of bacteria were identified by the presence of 16S rRNA.The results showed that the culturable counts ofSalmonella pullorumdecreased to zero by 55 days inducing.The total counts were unchanged with the prolonged inducing time,however viable count rapidly decreased by 180 days.TheSalmonella pullorumstrain entered VBNC at 55 days and non-culturable cells remained viable for up to 180 days.Cell shape changed from bacilus to coccus and cell alignment also changed from existing alone to gathering into VBNC.This studies established the foundation for VBNC cells identificaction and detection standard.

Salmonella pullorum;viable but non-culturable;resuscitation;16S rRNA

S852.61

A

1008-0589(2010）03-0179-04

*Correspondingauthor

2009-07-26

國家自然科學(xué)基金(30700594）；高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金(20070193002）資助

李 影(1977-），女，吉林通化人，副教授，博士，主要從事動(dòng)物微生物學(xué)教學(xué)與科研工作.

*通信作者：E-mail：thliying@163.com

(本文編輯：趙曉巖）