基于線粒體nad4基因探討土耳其斯坦東畢吸蟲的系統(tǒng)發(fā)生位置

王 宇，肖景瑩，王春仁*，高俊峰，朱興全

(1.黑龍江八一農墾大學 動物科技學院，黑龍江大慶 163319；2.佳木斯大學基礎醫(yī)學院，黑龍江佳木斯， 154007；3.華南農業(yè)大學獸醫(yī)學院，廣東廣州， 510642）

基于線粒體nad4基因探討土耳其斯坦東畢吸蟲的系統(tǒng)發(fā)生位置

王 宇1，肖景瑩2，王春仁1*，高俊峰1，朱興全3

(1.黑龍江八一農墾大學 動物科技學院，黑龍江大慶 163319；2.佳木斯大學基礎醫(yī)學院，黑龍江佳木斯， 154007；3.華南農業(yè)大學獸醫(yī)學院，廣東廣州， 510642）

為探討土耳其斯坦東畢吸蟲在血吸蟲中的系統(tǒng)發(fā)生位置，本研究設計一對特異性引物，通過PCR方法對土耳其斯坦東畢吸蟲(綿羊源）線粒體煙酰胺脫氫酶亞基Ⅳ基因(nad4）進行擴增和測序分析，并與GenBank中相關血吸蟲nad4基因進行比對。結果顯示，本研究克隆的該吸蟲線粒體nad4基因序列大小約為1 030 bp，與已發(fā)表的其它血吸蟲線粒體nad4基因的同源性為51.6%～66.7%，其系統(tǒng)發(fā)生位置屬于非洲血吸蟲種群。

土耳其斯坦東畢吸蟲；線粒體DNA；煙酰胺脫氫酶亞基Ⅳ基因；系統(tǒng)發(fā)生

土耳其斯坦東畢吸蟲(Orientobilharzia turkestanicum）是寄生于牛、羊等多種動物門靜脈和腸系膜靜脈的一種血吸蟲，引起動物的東畢吸蟲病，該蟲的尾蚴還可感染人，引起人的尾蚴性皮炎[1]。土耳其斯坦東畢吸蟲病主要分布于亞洲和歐洲的一些地區(qū)，常呈地方性流行，對畜牧業(yè)危害嚴重，該病為黑龍江省重要的吸蟲病之一[2]。

關于O.turkestanicum的分類地位，我們曾先后利用線粒體cox1和nad1基因和核糖體ITS和28SrDNA-LSU序列進行了一些研究工作，并推斷O.turkestanicum隸屬于非洲血吸蟲種群[3-4]。然而，在遺傳標記基因中，線粒體DNA(mtDNA）中的煙酰胺脫氫酶亞基Ⅳ基因(nad4）是一個進化率較高的基因，利用它作遺傳標記對寄生蟲進行群體遺傳和分類研究具有重要意義[5-7]。因此本研究以nad4基因作為標記基因，進一步探討O.turkestanicum在系統(tǒng)中的分類地位。

1 材料和方法

1.1 蟲體樣品 通過糞便檢查，選擇黑龍江省大慶市自然感染東畢吸蟲的綿羊，剖檢收集蟲體，經(jīng)形態(tài)學鑒定為O.turkestanicum，蟲體保存于70%乙醇中備用。

1.2 實驗材料 EasyPure Genomic DNA Extraction Kit和EasyPure Plasmid MiniPrep Kit購自北京全式金生物技術有限公司；StarPrep Gel Extraction Kit購自北京康潤誠業(yè)生物科技有限公司；pGEM-T購自Promega公司；LATaqDNA聚合酶、EcoRⅠ限制性內切酶和XhoⅠ限制性內切酶DNA Marker(DL2000、DL15000）購自寶生物工程(大連）有限公司；大腸桿菌(E.coli）感受態(tài)細胞TG1由本實驗室制備保存。

1.3 蟲體總DNA的提取 將15條土耳其斯坦東畢吸蟲成蟲置于無菌的1.5 mL離心管中，用北京全式金生物技術有限公司DNA抽提試劑盒提取蟲體總DNA，提取的DNA樣品置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4nad4基因的擴增與純化 根據(jù)GenBank登錄的梭形血吸蟲(NC_008067）和埃及血吸蟲(NC_008074）nad4基因保守區(qū)，設計一對用于擴增線粒體nad4基因的特異性引物，上游引物為5'-ATGTAT TCGAGTTCCGTTTGG-3'；下游引物為5'-AAAAAC TGAAGAGTTGGTGGAAACC-3'。PCR反應體系為25 μL；反應條件為：94℃10 min；94℃30 s、49℃30 s、72℃1.5 min，共30個循環(huán)，最后72℃延伸10 min。PCR擴增產物用1%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測后，進行純化。

1.5nad4基因的克隆 將純化nad4基因PCR產物與pGEM-T連接，轉化E.coliTG1感受態(tài)細胞，提取質粒DNA，然后進行PCR和雙酶切鑒定。

1.6nad4基因的測定與分析 經(jīng)過鑒定為陽性的nad4重組質粒由北京英駿生物技術公司進行測序，利用DNAStar和ClustalX1.83軟件對nad4基因序列進行比對，分析O.turkestanicum線粒體nad4基因與其他血吸蟲的nad4基因的同源性，利用MEGA3.1軟件，以肝片形吸蟲(Fasciola hepatica）為外群，采用鄰接法構建系統(tǒng)發(fā)生樹，探討O.turkestanicum在血吸蟲分類中的地位。

2 結果和討論

2.1nad4基因的擴增 應用特異性引物從分離的O.turkestanicum線粒體基因組DNA擴增出約為1 000 bp的nad4基因片段，與預期目的片段長度相符(圖1）。將PCR純化產物與pGEM-T載體連接后轉化E.coliTG1感受肽細胞，提取重組質粒DNA進行雙酶切鑒定。雙酶切鑒定結果表明，nad4基因成功克隆至pGEM-T載體的多克隆位點中。

2.2nad4基因的序列分析 經(jīng)DNAStar 6.0軟件分析，O.turkestanicum線粒體nad4基因的同源性和遺傳距離如表1所示。通過同源性比較及進化關系表明，O.turkestanicum與其它血吸蟲線粒體nad4基因的同源性為51.6%～66.7%，與梭形血吸蟲最為相近，同源性達到66.7%。

將O.turkestanicum的nad4基因與曼氏血吸蟲、埃及血吸蟲、梭形血吸蟲、湄公血吸蟲、日本血吸蟲等10種血吸蟲比較，其同源性在51.6%～66.7%之間，其中與梭形血吸蟲的同源性最高，可見，O.turkestanicum與梭形血吸蟲的親緣最近。

以肝片形吸蟲nad4基因作為該進化樹的外群，采用NJ法構建O.turkestanicum進化樹(圖2）。由血吸蟲nad4基因構建的進化樹可以看出，血吸蟲被分為兩個群：裂體屬的血吸蟲和其它屬的血吸蟲，其中O.turkestanicum的發(fā)生位置處于裂體屬血吸蟲中，裂體屬血吸蟲又被分為兩個群：非洲血吸蟲種群和亞洲血吸蟲種群，其中O.turkestanicum的發(fā)生位置處于非洲血吸蟲種群中。

與GenBank登錄的其他吸蟲的nad4基因的序列進行比對，我們得出結論，馬來血吸蟲、日本血吸蟲和湄公血吸蟲均屬于亞洲血吸蟲種群，而O.turkestanicum與埃及血吸蟲、曼氏血吸蟲、梭形血吸蟲以及羅海因血吸蟲均屬于非洲血吸蟲種群。這一結論與Li等和Wang等在對cox1、nad1、ITS1以及ITS2等基因的分析中所得出的結論一致[3-4]。

mtDNA為雙鏈閉環(huán)分子，具有獨立進化且速率比核DNA快、基因組精簡等特點[8]，同時由于線粒體為母系遺傳，線粒體基因間不發(fā)生重組，所以可以反映出母系的進化歷史，這樣線粒體一個基因就可以代表整個線粒體基因組的變異情況。線粒體基因在血吸蟲分類地位和種系發(fā)生的研究十分可靠，尤其是適合于較近緣的物種之間的研究，但應用較多的標記基因主要為cox1，應用nad4的較少。Blouin等通過對毛圓科(Trichostrongylidae）中的4個種的nad4序列進行種間和種內比較，分析得出nad4無論在種間還是在種內都具有高度的變異性和多態(tài)性[9]。通過對O.turkestanicum的nad4序列分析，發(fā)現(xiàn)其種間序列差異(32.3%～48.4%）大于cox1基因種間序列差異(20.4%～22.2%），表明線粒體nad4基因進化較快，比cox1基因更加適合用于寄生蟲分類地位的研究，這與Blouin等分析20種線蟲的cox1和nad4序列結果一致[10]。本研究結果表明，O.turkestanicum屬于非洲血吸蟲種群，這為進一步研究血吸蟲的起源提供了參考。

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Molecular phylogeny ofOrientobilharzia turkestanicumbased on nucleotide sequences of mitochondrialnad4gene

WANG Yu1,XIAO Jing-yin2,WANG Chun-ren1*,GAO Jun-feng1,ZHU Xing-quan3
(1.College of Animal Science and Veterinary Medicine,Heilongjiang Bayi Agricultural University,Daqing 163319,China;2.College of Basic Medicine,Jiamusi University,Jiamusi 154007,China;3.College of Veterinary Medicine,South China Agricultural University,Guangzhou 510642,China）

To determine the molecular phylogeny ofOrientobilharzia turkestanicumbased on nucleotide sequences of mitochondrialnad4gene encoding NADH dehydrogenase subunit 4,thenad4gene was amplified by PCR using the specific primers,sequenced and compared with related schistosomes in GenBank.The results showed that the nad4 sequence was 1 030 bp in length and shared 51.6%to 66.7%homology amongO.turkestanicumandschistosomaspecies.The phylogenetic tree revealed thatO.turkestanicumbelonged to african schistosome group.

Orientobilharzia turkestanicum;mitochondrial DNA;nad4;molecular phylogeny

S852.735

A

1008-0589(2010）03-0218-03

*Correspondingauthor

2009-08-23

廣東省動物源性人獸共患病預防與控制重點實驗室開放項目；黑龍江省教育廳科學技術研究項目(No.11511253）

王 宇(1984-），女，黑龍江哈爾濱人，研究方向為獸醫(yī)寄生蟲學與寄生蟲病學.

*通信作者：E-mail：chunrenwang@yahoo.com.cn

(本文編輯：陳立群）