大鼠心肌缺血再灌注模型構(gòu)建的改良

陳冰心，任 澎，段明軍，田 飛

(1.石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院，石河子 832000;2.新疆自治區(qū)人民醫(yī)院心內(nèi)科，烏魯木齊 830000; 3.新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)研究部，烏魯木齊 830054; 4.新疆自治區(qū)第三人民醫(yī)院心內(nèi)科，烏魯木齊 830002)

研究報(bào)告

大鼠心肌缺血再灌注模型構(gòu)建的改良

陳冰心1，2，任 澎1，2，段明軍3，田 飛4

(1.石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院，石河子 832000;2.新疆自治區(qū)人民醫(yī)院心內(nèi)科，烏魯木齊 830000; 3.新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)研究部，烏魯木齊 830054; 4.新疆自治區(qū)第三人民醫(yī)院心內(nèi)科，烏魯木齊 830002)

目的 改良大鼠心肌缺血再灌注模型的構(gòu)建方法，增強(qiáng)實(shí)用性。方法32只SD雄性大鼠隨機(jī)分為四組(A組:偽手術(shù)組;B組:缺血組;C組:缺血30 min再灌注組;D組:缺血60 min再灌注組)。缺血過程在人工機(jī)械通氣條件下完成，術(shù)前術(shù)中監(jiān)測心電圖變化，模型成功72 h后抽血進(jìn)行心肌酶譜分析，并觀察左室壓變化。結(jié)果造模成功率為91%。B、C、D組各心肌酶含量明顯高于A組(P＜0.05)，C、D組低于B組(P＜0.05)。B、C、D組左室壓值低于A組(P＜0.05)，C、D組高于B組(P＜0.05)。結(jié)論改進(jìn)后的模型制備方法簡便易行，成功率高，評價(jià)指標(biāo)符合臨床應(yīng)用。

模型，動(dòng)物;缺血再灌注;心肌;大鼠

由于大鼠冠脈走形及血液循環(huán)途徑上比較接近人類，且其冠狀動(dòng)脈側(cè)支循環(huán)少，心肌壞死出現(xiàn)早，穩(wěn)定性好，費(fèi)用低廉，大鼠心肌缺血再灌注損傷模型被廣泛用于該病發(fā)生發(fā)展機(jī)制的探索、可行性干預(yù)措施的研究等［1］。但縱觀近年各研究結(jié)果，均集中在對具體操作某一環(huán)節(jié)進(jìn)行改進(jìn)，且模型制作過程中隨意性大，存活率不穩(wěn)定。術(shù)后模型成功的評價(jià)也主要應(yīng)用病理學(xué)方法進(jìn)行檢測，這與臨床上對患者進(jìn)行心電監(jiān)測、心肌酶譜分析、心功能檢測的實(shí)際應(yīng)用不相符合。本實(shí)驗(yàn)綜合各模型制作的優(yōu)勢，注重細(xì)節(jié)的操作，就實(shí)用性、穩(wěn)定性等進(jìn)行了改進(jìn)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組:健康成年雄性SD大鼠32只，體重220～260 g［新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，SYXK(新)2003－0001］，隨機(jī)分為四組。A組:偽手術(shù)組(只穿線，不結(jié)扎)，B組:心肌缺血組(72 h)，C組:心肌缺血再灌注組1(心肌缺血30 min后再灌注)，D組:心肌缺血再灌注組2(心肌缺血60 min后再灌注)。

1.1.2 主要儀器與器械:小動(dòng)物呼吸機(jī)(成都泰盟，HX－200)、心電圖機(jī)(上海光電，ECG8951D)，心電監(jiān)護(hù)儀(邁瑞，Beneview T5)、顯微鏡(Carl ZEISS)、自制小拉鉤(曲別針彎曲而成)、氣管插管(16號套管針套)、動(dòng)脈插管延伸管(移液器槍頭拉制成長約10 cm，直徑約1.5 mm)、小塑膠管(24號套管針套，長約5 mm)、手術(shù)臺(長約50 cm，寬約40 cm泡沫板而制)、各種手術(shù)器械(顯微鑷、顯微針持、眼科剪等)、縫合針、可吸收腸線等(圖1，見彩插2)。

1.1.3 主要藥品與試劑:10%水合氯醛，注射用青霉素鈉，醫(yī)用生理鹽水等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 術(shù)前準(zhǔn)備:大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d，術(shù)前禁食12 h。稱重，10%水合氯醛按0.32 mL/100 g量腹腔注射麻醉(為避免扎到血管，正中腹白線外1 cm左右斜進(jìn)針，進(jìn)針后回抽)，個(gè)別大鼠可酌情追加劑量。麻醉后仰臥位于手術(shù)臺上，頭后仰位，經(jīng)口腔進(jìn)行氣管插管(注意清理口腔、氣道分泌物)。待呼吸、心率平穩(wěn)后，左側(cè)臥位固定于手術(shù)臺上，消毒左側(cè)胸前及腋窩下皮膚，并備皮。

1.2.2 胸部手術(shù):于胸骨左緣3、4肋間或4、5肋間，心臟搏動(dòng)最明顯處，沿肋骨走行斜向剪開皮膚約2 cm，逐層分離皮下組織、肌肉，暴露3、4肋間或4、5肋間，可看到心臟暗影，用彎頭止血鉗在心臟搏動(dòng)最明顯處打開肋間隙，與此同時(shí)連接呼吸機(jī)，以保持肺內(nèi)正壓，設(shè)定呼吸頻率60次/min，呼吸比為1:1，潮氣量為2 mL/100 g，有條件時(shí)可接氧氣。適應(yīng)3 min后，單人操作，用3枚自制拉鉤在左、右、上三方向拉開胸壁，另一端用廢針頭固定于手術(shù)臺上，調(diào)整拉鉤位置，充分暴露心臟，剪開心包膜，輕輕推開脂肪墊，顯示左心耳，持7－0針線，在其與肺動(dòng)脈圓錐之間的左冠狀動(dòng)脈前降支(left descending anterior branch，LAD)下穿一縫合線，打一松結(jié)，松結(jié)內(nèi)墊一小塑膠管，而后把冠脈及塑膠管一起進(jìn)行結(jié)扎，造成心肌缺血。隨后用一把直頭止血鉗夾閉皮膚及肌肉層，造成假關(guān)胸。規(guī)定時(shí)間后，松開止血鉗，再次打開胸腔，一把顯微鑷輕輕提起結(jié)扎的線頭，另一把顯微鑷順勢輕輕拔出墊管，恢復(fù)血流灌注。清理胸腔，擠壓關(guān)胸。肌肉層連同肋骨進(jìn)行8字縫合，皮膚及皮下脂肪層連續(xù)縫合。關(guān)胸前加大潮氣量，膨肺，3次呼吸后調(diào)為正常?？p合后用自制針頭抽吸胸腔內(nèi)殘留的氣體、液體，形成自然狀態(tài)下的負(fù)壓。撤出呼吸機(jī)，恢復(fù)自主呼吸后，輕輕拔出氣管插管，再次清理口腔及呼吸道。術(shù)后于青霉素鈉15萬單位肌注預(yù)防感染。手術(shù)時(shí)間長者可于尾靜脈少量補(bǔ)液。術(shù)中及術(shù)后注意保溫。

1.2.3 模型成功的判定:肉眼所見:結(jié)扎后可見結(jié)扎范圍心肌變白，血管供應(yīng)范圍心肌紫紺;再灌注后，心肌紫紺消失或減輕，變白心肌部分恢復(fù)紅色。心電圖示:結(jié)扎后ST段弓背抬高或與高聳的T波形成單向曲線，QRS波電壓增高或(且)波幅增寬;再灌注后，ST段及T波下落，QRS波趨于術(shù)前。

1.3 主要分析指標(biāo)

1.3.1 心電圖變化:于術(shù)前、結(jié)扎后(5 min、30 min、60 min)、再灌注后(5 min、15 min、30 min)的不同時(shí)間點(diǎn)分別測心電圖。觀察P波、QRS波、T波、ST段及心律失常發(fā)生情況。

1.3.2 心功能改變:72 h后，所有大鼠麻醉，頸部皮膚切開，分離頸總動(dòng)脈，用自制動(dòng)脈延伸管插入頸總動(dòng)脈，伸入左心室，接換能器，利用心電監(jiān)護(hù)儀觀察左室壓變化。

1.3.3 心肌酶譜檢測:測定心功能后，打開大鼠腹腔，進(jìn)行腹主動(dòng)脈取血，標(biāo)本靜置30 min后離心，取血清檢測肌酸激酶(Creatine Kinase，CK)、肌酸激酶同工酶(Creatine Kinase－MB，CK－MB)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(Aspartate Aminotransferase，AST)、乳酸脫氫酶(Lactate Dehydrogenase，LDH)水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間采用單因素方差分析，兩組間采用LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，32只大鼠總死亡率12.5%，其中B組一只死于手術(shù)過程中，另一只在術(shù)后第2天死亡，C組一只死于手術(shù)過程中，D組一只死于術(shù)后第3天?？紤]手術(shù)過程中死亡的原因與結(jié)扎位置過高，從而出現(xiàn)廣泛心肌梗死及惡性心律失常有關(guān);而術(shù)后死亡的原因經(jīng)尸檢考慮與心力衰竭有關(guān)。其余實(shí)驗(yàn)大鼠于取標(biāo)本時(shí)，精神狀態(tài)良好，呼吸、心率平穩(wěn)。冠脈結(jié)扎的24只大鼠，除兩只死于缺血過程，余22只均出現(xiàn)心梗變化，造模成功率為91%。

2.2 心電圖改變

P波及QRS波變化:缺血期B、C、D組24只大鼠，結(jié)扎后10只出現(xiàn)P波低平、倒置、雙向，其中6只在缺血40 min后，P波逐漸恢復(fù)正常。24只大鼠均出現(xiàn)一過性 R波電壓增高，其中16只出現(xiàn) QRS波的增寬，缺血5min后，R波逐漸降低。再灌注期，P波均恢復(fù)正常，R波電壓回落至正常但有6只增寬的QRS波未回落。缺血后期及再灌注期可出現(xiàn)Q波或Q波加深。A組無變化。

ST段及T波:缺血期24只大鼠，結(jié)扎LAD后，4只出現(xiàn)ST的弓背抬高，其余皆與T波融合成單向曲線。再灌注期，ST段及T波回落。A組大鼠3只在術(shù)后出現(xiàn)ST段的壓低。

心律失常情況:22只大鼠16只發(fā)生室性心律失常，多出現(xiàn)在缺血和再灌注早期，以室性早搏、二連律為最多，多數(shù)可自行或經(jīng)利多卡因棉球擦拭后恢復(fù)(圖2)。

圖2 心電圖變化Fig.2 The changing of ECG

2.3 對心肌酶譜的影響

B、C、D組的CK、AST及B、D組的CK－MB、LDH較A組均顯著升高(P＜0.01);C組CK－MB、LDH較A組顯著升高(P＜0.05);C、D組的CK、CK－MB、LDH、AST較B組均顯著降低(P＜0.01);C組的CK、CK－MB、LDH、AST均低于D組(P＜0.01)(表1)。

表1 各組血清心肌酶AST、CK、CK－MB、LDH含量比較Tab.1 Comparison of the level of plasma AST，CK，CK－MB and LDH in various groups

2.4 左心室壓變化情況

A、B、C、D組左室壓分別為:120.875±11.763 mmHg、63.833±17.680 mmHg、85.857±13.397 mmHg、83.857±15.159 mmHg。B、C、D組左室壓較A組顯著降低(P＜0.01);C、D組左室壓均顯著高于 B組(P＜0.05);C、D組比較無顯著差異(P＞0.05)。

3 討論

模擬心肌缺血－再灌注損傷疾病模型的制作方法從解剖位置上可分為兩種:原位結(jié)扎和胸腔外結(jié)扎。在此基礎(chǔ)上，具體操作又可分為推管法和墊扎法。此外，在具體實(shí)施時(shí)又有許多細(xì)節(jié)的不同。我們經(jīng)過預(yù)試驗(yàn)的摸索，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室條件，對該模型制作做了綜合改進(jìn):1.采用原位結(jié)扎及墊管法。原位結(jié)扎可使心臟處于正常解剖位置，對于術(shù)后大鼠的心臟生理功能影響較小，可提高術(shù)后動(dòng)物的存活時(shí)間，適合慢性再灌注的實(shí)驗(yàn)研究。對于其視野小、操作困難等缺點(diǎn)我們采用3把自制拉鉤打開胸腔。實(shí)驗(yàn)證明，自制拉鉤不僅可以充分暴露心臟，而且靈活、損傷小，避免了使用擴(kuò)胸器、開瞼器等帶來的損傷及操作不便，很好的解決了原位結(jié)扎的局限性，同時(shí)制作拉鉤的原材料常見且經(jīng)濟(jì)，任何實(shí)驗(yàn)室均可具備。對于冠脈結(jié)扎我們?nèi)杂脡|管法，自制塑膠管較常見且實(shí)驗(yàn)效果與特制的聚乙烯小管及改進(jìn)后應(yīng)用的魚線、球囊無明顯差異［2，3］。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，我們未發(fā)現(xiàn)有些學(xué)者提出的管不易固定和缺血效果不好等問題［4］，而且在具體操作中證明墊扎法比推管法、打活結(jié)法更易操作。2.應(yīng)用動(dòng)物呼吸機(jī)。保持肺內(nèi)正壓，避免動(dòng)物在手術(shù)過程中缺氧對于實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾。術(shù)后動(dòng)物清醒快，存活率高。3.經(jīng)口腔進(jìn)行氣管插管。自制氣管插管實(shí)用性較強(qiáng)，操作簡易。經(jīng)口腔插管可減少創(chuàng)傷，避免術(shù)后感染、氣道分泌物增多、氣道塌陷等，可延長存活時(shí)間，適用于慢性再灌注的實(shí)驗(yàn)觀察。4.固定采用左側(cè)臥位，使前降支定位簡單化。同時(shí)不剪斷肋骨，減少動(dòng)物創(chuàng)傷。5.術(shù)中、術(shù)后注意保溫。我們在預(yù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)麻醉劑對于動(dòng)物的體溫影響很大，間接的降低了動(dòng)物承受手術(shù)的能力，全程保溫后大大提高了術(shù)后的存活率。

我們的資料顯示大鼠心率較快，體表心電圖 T波起始與QRS波相融合，無明確 ST段，且ST段還受心肌損傷的影響，而 T波電壓的變化更直觀、更容易測量，我們認(rèn)為一定程度上可以替代 ST段作為模型成功的指標(biāo)。資料還顯示Q波變化，提示心肌壞死的形成，也可作為造模成功的指標(biāo)之一。這與國內(nèi)研究基本一致［5］。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果觀察到QRS波也出現(xiàn)了變化，這可能與急性損傷的心肌組織出現(xiàn)傳導(dǎo)延遲有關(guān)。血管再通后，QRS波應(yīng)該回落，不回落代表再通不良，我們認(rèn)為QRS波變化也可以作為模型制作成功與否的觀察指標(biāo)之一。我們實(shí)驗(yàn)中有6只未見回落，考慮與再灌注時(shí)間短有關(guān)，我們監(jiān)測的是再灌30min后的心電圖，心肌缺血時(shí)間長會(huì)出現(xiàn)心肌細(xì)胞頓抑現(xiàn)象，隨著時(shí)間的延長，是否會(huì)回復(fù)正常，將有待進(jìn)一步研究。實(shí)驗(yàn)中我們觀察到有73%大鼠出現(xiàn)心律失常，比國內(nèi)報(bào)道數(shù)值高，但在臨床血管再通后，心律失常發(fā)生率卻不高［6］，差異原因?qū)⒂写钊胙芯俊?/p>

以往造模成功后的評價(jià)指標(biāo)都集中在病理學(xué)范疇，如Evan’s藍(lán)染色、TTC染色等，染色后比較心肌梗死面積的范圍，但不同個(gè)體血管變異性較大，供應(yīng)范圍不等，且與臨床上常用的評價(jià)指標(biāo)不符，我們認(rèn)為單純以此值作為評價(jià)指標(biāo)在實(shí)際應(yīng)用上欠妥當(dāng)。我們采用心肌酶譜分析、心功能測定來評價(jià)，符合臨床實(shí)際應(yīng)用［7］。我們資料顯示各心肌酶指標(biāo)缺血組及再灌注組比對照組均明顯升高，但缺血30 min組低于缺血60 min組，說明血管開通后，可使心肌梗死范圍大大縮小，血管開通越早，心肌梗死程度越輕。左室壓變化亦類似，血管開通后，心功能降低程度減輕。但缺血30 min變化與缺血60 min變化差異無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這可能與大鼠心肌細(xì)胞對缺血的耐受性有關(guān)，缺血30 min和缺血60 min都造成了心肌細(xì)胞缺血損傷，再灌注只能避免缺血心肌細(xì)胞進(jìn)一步損傷，對于已梗死的心肌細(xì)胞無改善作用。

改進(jìn)的造模方法能夠成功的復(fù)制心肌 I/R模型，實(shí)用性強(qiáng)、成功率高、操作簡易且經(jīng)濟(jì)，可在大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室條件下進(jìn)行。但本實(shí)驗(yàn)仍存在一些問題。我們的模型制作仍是以大鼠麻醉狀態(tài)為前提，對于急性心肌梗塞患者是在清醒狀態(tài)下接受溶栓或PCI術(shù)，如用清醒自由活動(dòng)大鼠研究心肌缺血再灌注損傷，將更接近人類疾病的發(fā)生情況。我們對于心功能測定是采用有創(chuàng)的左室壓變化來評價(jià)，此方法有其局限性。這些問題我們將在后續(xù)試驗(yàn)中進(jìn)一步摸索。

［1］ 張健發(fā)，馬依彤，楊毅寧，等.小鼠心肌缺血后適應(yīng)模型的建立及其相關(guān)影響因素［J］.中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2007，17(10):576－580.

［2］ 唐曉敏，汪克明.改良式大鼠心肌缺血再灌注模型的復(fù)制［J］.浙江中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，(1):49－51.

［3］ 趙秀敏，孫勝，劉秀華.墊扎球囊法復(fù)制大鼠在體心肌缺血/再灌注模型［J］.中國微循環(huán)，2007，11(3):206－208.

［4］ 王曉樑，劉磊，梁峰，等.大鼠在體心肌缺血/再灌注模型制備方法的改進(jìn)［J］.山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，37(9):980－982.

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［7］ 楊迪成，肖明第，盧成寶.心肌缺血－再灌注模型血流動(dòng)力學(xué)的實(shí)驗(yàn)研究［J］.醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào)，2006，19(6):524－529.

Improvement of Establishing a Myocardial Ischemic Reperfusion Model in Rats

CHEN Bing－xin1，2，REN Peng1，2，DUAN Ming－jun3，TIAN Fei4
(1.Shi Hezi Medical College，Shehezi 832000，China;2.People Hospital of Xingjiang，Urumqi 830000，China; 3.First Affiliated Hospital of Xingjiang Medical University，Urumqi 830054，China; 4.Third People Hospital of Xingjiang，Urumqi 830002，China)

ObjectiveTo improve the method of establishing model in myocardial ischemic reperfusion rat. Methods 32 SD male rats were divided into four groups randomly(Group A:sham group，Group B:myocardial ischemic，Group C:ischemic 30 min and reperfusion，Group D:ischemic 60 min and reperfusion).Inspected the changing of ECG in preparation/in－operation and rats breathing were finished under the control of artificial respirator in the period of MI.After 72 h of the operation，the levels of myocardial zymogram were determined and the left ventricular pressure was traced. Results Survival rate was 91% after operation.Myocardium zymogram content in the group B，C，D was significantly higher than that of group A(P＜0.05);Myocardium zymogram content in group C、D was lower than that of group B(P＜0.05).The left ventricular pressure in group B，C，D was lower than that of group A(P＜0.05);The left ventricular pressure in group C、D was higher than that of group B(P＜0.05)。ConclusionThe improving method is convenient，higher survival rate，and the evaluation was according with clinical procedures.

Model，animal;Ischemia－reperfusion;Myocardial;Rat

R542.2

A

1671－7856(2010)05－0024－05

2009－11－26

新疆自治區(qū)自然科學(xué)基金(200821117)。

陳冰心(1984－)，女，住院醫(yī)師，碩士生，主要從事冠心病的臨床與基礎(chǔ)研究。E－mail:chen115150@163.com

任澎，男、主任醫(yī)師、博士、主要從事冠心病的臨床與基礎(chǔ)研究。E－mail:renpengcvd@126.com