林木植原體病害傳播及PCR檢測(cè)研究進(jìn)展

劉文汝，甄志先,2

(1 河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，河北 保定 071001； 2 河北省林木種質(zhì)資源與森林保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 保定 071000)

近年國(guó)內(nèi)部分地區(qū)在進(jìn)行林木種植及育種工作時(shí)，為追求育林速度及短期效益，常進(jìn)行單一或少量幾種樹種的種植及研究，結(jié)果造成林木樹種組成結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，品種固化，遺傳基礎(chǔ)減小，林木病蟲害感染風(fēng)險(xiǎn)增加。而目前國(guó)內(nèi)林木病害研究多集中于細(xì)菌、真菌、病毒性病害，對(duì)于其他類型的病害則關(guān)注較少。

植原體病害，病原為植原體(Candidatusphytoplasma)，原名類菌原體(MLO)，分類上隸屬于細(xì)菌界，軟菌綱，是一類定殖于植物韌皮部的侵染性病害，廣泛發(fā)生于世界各地。因傳播特性、傳播方式與病毒類似，常造成多種植物間的交叉感染，因而傳播規(guī)律較難掌握。近年該病害在園林綠化及苗木繁育中多有發(fā)生，常導(dǎo)致植物體內(nèi)激素代謝紊亂，進(jìn)而發(fā)生葉片小葉、黃化、萎蔫、皺縮[1]和枝條叢生、帶化[2]等癥狀，據(jù)報(bào)道該類病害已危害1 000多種植物，我國(guó)發(fā)現(xiàn)已達(dá)100多種[3]。不但可危害糧食、棉花、油料、花卉、藥材、蔬菜等許多糧食作物、經(jīng)濟(jì)作物，同時(shí)還危害果樹、橡膠、桑、竹、銀杏等林木和珍貴樹種，對(duì)人類經(jīng)濟(jì)、生活均有重大影響。其中，棗瘋病[4]和泡桐叢枝病[5]危害日益嚴(yán)重，如新鄭和濮陽(yáng)的2處放任棗園，發(fā)病率分別達(dá)到了76%和50%，發(fā)病指數(shù)分別達(dá)到了107和57程度[6]。不僅極大地影響了樹木的正常生長(zhǎng)，而且使得林木在園林綠化中的美觀性以及經(jīng)濟(jì)效益顯著降低。但因植原體為無細(xì)胞壁原核生物，粒子直徑為800～1 000 nm，形態(tài)因?qū)ν饨鐗毫γ舾?，呈現(xiàn)多變性[7]，且培養(yǎng)條件極其苛刻[8]，對(duì)其進(jìn)行傳播規(guī)律及檢測(cè)研究較為困難，常規(guī)方法檢測(cè)鑒定該類病害難度較大且準(zhǔn)確性較低。近些年隨著分子技術(shù)的逐漸成熟，利用分子技術(shù)去準(zhǔn)確檢測(cè)鑒定植原體類病害及發(fā)病程度成為該類病害研究的主要技術(shù)手段。

通過綜合闡述近年林木植原體病害傳播侵染特性和所采取的分子檢測(cè)技術(shù)，綜述討論其進(jìn)展成果，并展望其面臨主要問題及未來發(fā)展趨勢(shì)，以期為相關(guān)林木植原體病害的快速檢測(cè)和防控研究提供理論參考。

1 林木植原體病害傳播特點(diǎn)

1.1 林木植原體病害的流行

植原體的寄生部位為植物韌皮部的篩管部分，在傳播侵染成功后，會(huì)使得植物體的整個(gè)養(yǎng)分輸導(dǎo)系統(tǒng)均有可能攜帶植原體病菌。而植物體的某些寄生于韌皮部組織的外部寄生者，如刺吸類害蟲、菟絲子等，從而間接充當(dāng)植原體的外部自然傳播媒介，尤其當(dāng)這些傳播媒介具有比較廣泛的寄主范圍時(shí)，極有可能造成一定范圍內(nèi)植原體病害的流行。

植原體的寄主范圍較廣，裸子植物、單子葉植物以及雙子葉植物均可被其侵染[9]。王潔等[5]通過對(duì)泡桐叢枝病源附近的16種植物進(jìn)行調(diào)查以及植原體分子檢測(cè)鑒定，發(fā)現(xiàn)其中7種植物為植原體所侵染，并且推測(cè)這7種植物可能被泡桐叢枝植原體的自然寄主。盡管在某些林木植原體病源附近可能會(huì)發(fā)現(xiàn)該類植原體的自然寄主，但相關(guān)研究表明一種植原體群體內(nèi)的 16SrDNA 序列往往并不一致，多樣性較豐富[10]。Padovan等[11]報(bào)道通過 PCR-RFLP技術(shù)對(duì)番木瓜植原體病源附近作物和雜草進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，植原體的RFLP 類型株系高達(dá)6種，其中，2個(gè)優(yōu)勢(shì)類型高達(dá)總比例的 94%，這說明植原體可以通過某些昆蟲或其他寄生生物實(shí)現(xiàn)林木與其周圍植物間的交叉感染，并且植原體可能會(huì)隨侵染寄主的改變從而產(chǎn)生某些菌株變化或基因型的改變。據(jù)顧沛雯等[12]研究結(jié)果表明小麥藍(lán)矮植原體病害在其外部傳播媒介昆蟲的介導(dǎo)下，同時(shí)具有初侵染源、越夏寄主和過渡寄主等多個(gè)侵染源，而與小麥等草本植物相比，林木作為木本植物可能具有較長(zhǎng)的生長(zhǎng)年限，寄生于林木的植原體可能并不存在越冬、越夏等過渡寄主，但因其傳播媒介特性，如某些昆蟲的雜食性或以林下雜草作為產(chǎn)卵或幼蟲的過渡寄主，這些寄主可能成為林木植原體病害的間接寄主。

1.2 人為因素介導(dǎo)的林木植原體病害傳播

植原體的人為傳播特點(diǎn)與病毒類似，其可以在較短時(shí)間內(nèi)隨植物汁液通過植物傷口進(jìn)行傳播，林木在人為管控過程中需要嫁接、修剪等處理，因修剪工具未及時(shí)進(jìn)行消毒處理，會(huì)造成植原體大規(guī)模人為傳播。但影響最大的人為傳播方式主要是繁殖材料帶有植原體病菌，植原體可以通過無性繁殖手段進(jìn)行傳播，包括嫁接、扦插等[13]。葛泉卿[14]研究結(jié)果表明修剪下的外表正常的葡萄藤在嫁接后可以傳播葡萄植原體黃化病，但是并不是從染病植株上剪下的枝條均會(huì)傳播植原體，這種結(jié)果證明植原體在寄主植物內(nèi)部的分布并不均勻。而且植原體在侵染之后，寄主顯現(xiàn)危害癥狀可能對(duì)侵染的植原體濃度有最低限度要求，Rafeket等[15]發(fā)現(xiàn)葡萄在受植原體侵染后，從看似正常無癥狀的枝條內(nèi)可以檢測(cè)到病菌的存在，因而這種情況下在挑選其作為繁殖材料時(shí)極易造成植原體的人為傳播，Caudwell(1994)等[16]已經(jīng)證實(shí)若干砧木品種已成為植原體黃化病的主要傳播宿主。另一方面，基于林木植原體病害可以通過嫁接傳播的特性，嫁接侵染已經(jīng)成為檢測(cè)繁殖材料健康及鑒定該類病害的主要手段，穆雪等[17]研究結(jié)果表明將帶有植原體病害癥狀的櫻桃接穗嫁接到健樹上，健樹在2 d后表現(xiàn)有植原體病害癥狀。

1.3 自然媒介介導(dǎo)的林木植原體病害傳播

植原體的自然媒介傳播方式是導(dǎo)致其大規(guī)模侵染及反復(fù)發(fā)病的主要原因。自然傳播媒介大致可分為兩類，一類是主要寄生于植物韌皮部的刺吸類昆蟲，另一類為寄生植物，如菟絲子。據(jù)報(bào)道，植原體細(xì)胞表面具有一種主要的抗原性蛋白，并且最近被證明與昆蟲腸道肌肉的微絲復(fù)合體相互作用。這種蛋白質(zhì)被認(rèn)為對(duì)傳播和感染都很重要[18-19]，這說明植原體在長(zhǎng)期的侵染過程中已進(jìn)化成與傳播宿主昆蟲之間的高度互作。有研究表明葡萄枝條在被AY 植原體侵染后，其枝條顏色可能發(fā)生改變，從而具備發(fā)揮引誘Mgenia fuscovaria 成蟲的功能[20]。刺吸類昆蟲在取食含有植原體病菌的植物汁液后，植原體顆粒通過一段時(shí)間的“潛伏期”，會(huì)寄生于昆蟲的唾液腺組織，但在感染其他植物之前，唾液腺內(nèi)的植原體一般會(huì)繁殖到能夠感染健康植物的劑量[21]，并在昆蟲取食其他植物時(shí)，通過分泌唾液轉(zhuǎn)寄于寄主植物[22]。植原體的昆蟲傳播媒介主要為葉蟬科、褐飛虱科和木虱科昆蟲[13]，目前已經(jīng)證實(shí)木虱可以傳播多種果樹植原體病害，包括歐洲堅(jiān)果黃化病、蘋果叢枝病和梨樹衰退病等病害[23]。近年關(guān)于菟絲子傳播植原體病害的相關(guān)研究較少，有研究表明菟絲子主要通過其在健康植株與病株之間所建立的“養(yǎng)分輸導(dǎo)系統(tǒng)”進(jìn)行植原體病害的傳播，因而一些實(shí)驗(yàn)室借助于菟絲子進(jìn)行植原體病害的研究，如Jaroslava等[24]利用菟絲子進(jìn)行紅醋栗到長(zhǎng)春花之間的植原體傳播研究。

2 PCR技術(shù)在林木植原體病害中的應(yīng)用

2.1 林木植原體的通用引物設(shè)計(jì)

在經(jīng)過上億年的漫長(zhǎng)進(jìn)化后，細(xì)菌rRNA在核苷酸序列、堿基組成以及高級(jí)結(jié)構(gòu)及生物功能等方面均表明其具有高度保守性，并進(jìn)而能夠反映細(xì)菌之間的親緣關(guān)系[24]，在進(jìn)行細(xì)菌分類時(shí)廣泛應(yīng)用編碼其核酸染色體的基因片段16SrDNA進(jìn)行菌群區(qū)分、分子鑒定，其長(zhǎng)度約為1 500 bp，長(zhǎng)度適中，另外序列中具有10個(gè)可變區(qū)并相間分布有11個(gè)恒定區(qū)，因而保守序列較多，且研究表明其可變區(qū)與細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系密切。因而眾多研究工作者根據(jù)這一特性，利用16SrDNA進(jìn)行細(xì)菌通用引物的設(shè)計(jì)[25-27]，其既可以高度特異擴(kuò)增出含有16SrDNA的細(xì)菌，同時(shí)又可以利用細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育中所產(chǎn)生的16SrDNA可變區(qū)差異進(jìn)行細(xì)菌不同種類的劃分[28]。植原體，分類地位所屬細(xì)菌界，在對(duì)其進(jìn)行分子檢測(cè)時(shí)也往往根據(jù)16SrDNA設(shè)計(jì)通用引物，因而在進(jìn)行植原體病菌檢測(cè)時(shí)往往需要根據(jù)病菌特性進(jìn)行通用引物的篩選與選擇，李橫虹等[29]在進(jìn)行櫻桃?guī)Щ》肿訖z測(cè)以及王潔等[30]在進(jìn)行柿樹帶化病分子檢測(cè)時(shí)均選用植原體通用引物R16MF2(5′-CATGCAAGTCGAACGGA-3′)/R16MR1(5′-CTTAACCCCAATCATCGAC-3′)以及巢式引物R16F2(5′-ACGACTGCTAAGACTGG-3′)/R16R2(5′GCGG GTGTACAAACCCCG-3')進(jìn)行病菌鑒定，而在進(jìn)行杏黃化病[31]分子檢測(cè)時(shí)以及在進(jìn)行石榴帶化病[32]病原檢測(cè)時(shí)均選用直接引物P1(5′-AAGAGTTTGATCCTGGCTCAGGA TT-3′)/P7(5′-CGTCCTTCATCGGCTCTT-3′)和巢式引物R16F2n(5′-GAAACGACTGCT AAGACTGG-3′)/R16R2(5′-TGACGGGCGG TGTGTACAAACCCCG-3′)進(jìn)行病菌鑒定。最近在進(jìn)行Ziziphus oenoplia叢枝病[33]分子檢測(cè)時(shí)，選用的巢氏引物為P1(5′-AAGAGTTTGATCC TGGCTCAGGATT-3′)/P7(5′-CGTCCTTCAT CGGCTCTT-3′)和3Far(5′-ACCTGCCTTTAAGACGAGGA-3′)/3Rev(5′-AAAGGAGGTG ATCCATCCCCACCT-3′)，雖然相關(guān)文獻(xiàn)并沒有提到選用植原體通用引物的具體原因，這可能與植原體序列16SrDNA的長(zhǎng)短有較大關(guān)系。

2.2 PCR檢測(cè)擴(kuò)增的基因

rp基因?yàn)楹颂求w蛋白基因，其序列保守性與16SrDNA相似，但存在可變區(qū)更大，因而在進(jìn)行植原體鑒定時(shí)挖掘出系統(tǒng)發(fā)育的標(biāo)記以及更多有用信息，有利于進(jìn)行植原體檢測(cè)鑒定時(shí)一些親緣關(guān)系較近而無法區(qū)分的植原體株系研究[34-35]。tuf基因廣泛存在于細(xì)菌內(nèi)部，其生理功能為生物蛋白合成中負(fù)責(zé)肽鏈的延伸，其保守性同上述2類基因類似，但同樣具有較強(qiáng)的可變性，因而與rp基因一致，更加適合研究親緣關(guān)系較近的植原體亞組間分類鑒定、系統(tǒng)發(fā)育研究[36]。因此，基于上述2類基因特性，在進(jìn)行林木帶化病及植原體類病害分子檢測(cè)研究時(shí)，往往在進(jìn)行16SrDNA基因序列分析的同時(shí)結(jié)合rp或tuf基因進(jìn)行克隆、分子檢測(cè)以及生物信息分析，這樣既能避免16SrDNA基因分子檢測(cè)出現(xiàn)的假陽(yáng)性問題，也能夠?yàn)閹Щ≡b定提供證據(jù)支撐，如在進(jìn)行國(guó)槐帶化病[6]、竹柏扁枝病病原[37]以及棗瘋病[38]等林木植原體類病害分子檢測(cè)時(shí)均借助這種方法確定病原且進(jìn)而確定其系統(tǒng)分類地位。

2.3 PCR檢測(cè)方法的種類

2.3.1 直接PCR PCR技術(shù)通過體外獲得植物DNA片段，進(jìn)而通過相應(yīng)引物設(shè)計(jì)以及快速循環(huán)擴(kuò)增，可以有效且準(zhǔn)確分離獲得病原菌核酸產(chǎn)物，因而廣泛用于不可體外培養(yǎng)進(jìn)行形態(tài)及其他組織學(xué)觀察鑒別的病原菌、病害的分離鑒定。林木帶化病作為植原體類病害，在Deng等[39]首次通過PCR技術(shù)檢測(cè)鑒定翠菊黃化病植原體后，PCR擴(kuò)增技術(shù)被廣泛用于林木帶化病病原檢測(cè)。近年，Nawres Al-Kuwaiti等人通過直接PCR的方法應(yīng)用引物 ‘P1/P7’成功檢測(cè)到沙橄欖叢枝病、豇豆帶化病病原[40]，但Berges等[41]研究發(fā)現(xiàn)表現(xiàn)帶化癥狀的組織與明顯叢枝癥狀的植物組織相比，病菌濃度相對(duì)較低，同時(shí)據(jù)Lee等[42]研究，由于植物體總DNA濃度以及植物體內(nèi)酚、蛋白等抑制物質(zhì)影響，直接PCR技術(shù)往往易產(chǎn)生假陰性，王潔等[30]在進(jìn)行柿樹帶化病分子檢測(cè)時(shí)，通過直接PCR手段并未擴(kuò)增出病原特異條帶。

2.3.2 巢式PCR 巢式PCR技術(shù)是在直接PCR技術(shù)基礎(chǔ)上衍生出的一種靈敏度以及特異性更高的一種PCR技術(shù)[43]，由于林木帶化病組織中病原菌濃度相對(duì)較低，據(jù)劉秉勝等[44]的研究，植物體不同器官中的植原體病菌濃度隨季節(jié)時(shí)間的變化具有較大差異，且感病組織中植原體濃度會(huì)隨溫度升高而逐漸增多，因而受季節(jié)溫差變化影響較大[45]，而常規(guī)直接PCR在癥狀表現(xiàn)輕微或病菌濃度較低時(shí)應(yīng)用結(jié)果常呈現(xiàn)假陰性，且據(jù)研究巢式PCR靈敏度比直接PCR高出至少1 000倍[46]，因而目前巢式PCR非常適合林木帶化病及相關(guān)植原體類病害病原檢測(cè)。它是通過采取第1次直接PCR所得產(chǎn)物進(jìn)行一定程度稀釋，而后直接作為第2次PCR模板，并采取不同引物進(jìn)行再次擴(kuò)增的一種PCR技術(shù)，有時(shí)可能根據(jù)病菌特性或者PCR結(jié)果進(jìn)行3次、4次或多次PCR。目前國(guó)內(nèi)外最新發(fā)現(xiàn)并報(bào)道的林木植原體病害均是主要依靠該方法進(jìn)行檢測(cè)鑒定：如杏黃化病[31]、桃叢枝病[47]、石榴帶化病[32]、酸角黃化病[48]等。

2.3.3 實(shí)時(shí)熒光PCR 近些年，實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)也逐漸應(yīng)用于植原體類病害病原檢測(cè)，因其封閉性以及與巢式PCR相當(dāng)?shù)撵`敏性，使其能夠完全應(yīng)用于林木帶化病害病原檢測(cè)的同時(shí)，避免產(chǎn)生巢式PCR中出現(xiàn)的假陽(yáng)性問題。由研究者設(shè)計(jì)并以能成功運(yùn)用的光譜熒光探針，經(jīng)試驗(yàn)不僅可以快速檢測(cè)植原體，同時(shí)可以進(jìn)行植原體與細(xì)菌間的區(qū)分，特異性較高[49]。因而可能更適合林木帶化病害的病原檢測(cè)，張?zhí)鹛鸬萚50]通過對(duì)泡桐叢枝、棗瘋、白蠟?zāi)军S化、蘋果叢枝和榆樹黃化等12種植原體病害進(jìn)行基于TaqMan 探針的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)，并同時(shí)以健康植株作為對(duì)照，結(jié)果表明檢測(cè)的所有植原體材料均獲得較高的熒光信號(hào)并具有較高的特異性。另外，實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)具有準(zhǔn)確、定量檢測(cè)的特點(diǎn)，所以根據(jù)這一特性，相關(guān)研究近年多應(yīng)用其進(jìn)行寄主不同部位的病原濃度檢測(cè)。任爭(zhēng)光等[51]通過檢測(cè)不同抗棗瘋病棗樹接穗中的植原體濃度，成功建立棗瘋病植原體實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)體系，其結(jié)果表明棗瘋病寄主的發(fā)病嚴(yán)重程度與其內(nèi)部的植原體濃度成正相關(guān)。

3 高通量測(cè)序

高通量測(cè)序是同時(shí)對(duì)幾十到幾百萬(wàn)條DNA分子進(jìn)行測(cè)序，并且可以對(duì)轉(zhuǎn)錄組及基因組同時(shí)進(jìn)行分析。因此，在對(duì)帶病植物組織進(jìn)行高通量測(cè)序時(shí)，不僅可以快速準(zhǔn)確反映帶病組織內(nèi)部病原信息[52]，同時(shí)還可以反映植物組織內(nèi)部生理狀態(tài)，從而獲悉其致病機(jī)理以及組織內(nèi)部微生物群落相互關(guān)系，確定生防菌。自病毒病害中首次應(yīng)用高通量測(cè)序技術(shù)獲得成功以來，該項(xiàng)技術(shù)在未知病源物研究方面展現(xiàn)了巨大的優(yōu)勢(shì)[53]，因而近年相關(guān)研究通過利用該項(xiàng)技術(shù)針對(duì)一些未鑒定的植原體病害進(jìn)行分析鑒定和致病機(jī)理研究，Mardi等[54]通過對(duì)酸橙植原體病害進(jìn)行高通量測(cè)序研究，不僅對(duì)植原體的基因表達(dá)進(jìn)行了鑒定分析，同時(shí)確定出差異基因上調(diào)和下調(diào)的主要富集代謝通路，對(duì)于該類病害的深入研究和驗(yàn)證提供了理論依據(jù)。另外，由于病毒類病害和植原體病害傳播方式、致病特點(diǎn)比較相似，所以常導(dǎo)致某些研究相對(duì)較少的植原體病害病原與病毒的混淆，而通過高通量測(cè)序手段則可以針對(duì)其進(jìn)行病原鑒定，例如張馳等[55]就通過高通量測(cè)序技術(shù)成功鑒定出慈姑黃化病的侵染病原主要為植原體，但目前因其花費(fèi)較大，可能并未在林木植原體病害研究中普及。

4 展望

隨著分子檢測(cè)技術(shù)的不斷發(fā)展，林木帶化病病原分子檢測(cè)、鑒定工作也逐漸向快速、靈敏、準(zhǔn)確這一目標(biāo)轉(zhuǎn)變，如國(guó)槐帶化病由起初僅僅確定病原為類菌原體(MLO)[56]，到如今確定分類地位為翠菊黃花組植原體[6]。綜上所述，目前林木植原體病害病原分子檢測(cè)主要應(yīng)用基于16SrDNA基因的巢式PCR技術(shù)，雖其靈敏度較高，但因其操作過程的開放性極易造成痕量污染，從而出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。此外由于林木植原體病害在目前林業(yè)研究中并未引起足夠重視，進(jìn)而造成諸如免疫捕捉PCR技術(shù)、競(jìng)爭(zhēng)PCR技術(shù)、基因芯片、多重PCR技術(shù)及高通量測(cè)序等在某些植原體病害以及病毒、真菌類病害中已相對(duì)比較成熟的分子檢測(cè)手段未能引入相關(guān)林木植原體病害內(nèi)進(jìn)行應(yīng)用，例如現(xiàn)在比較流行的帶化病，雖然目前已有部分地區(qū)進(jìn)行如國(guó)槐帶化病、柿樹帶化病等巢式PCR檢測(cè)成功結(jié)果，但因其地域局限性及試驗(yàn)重現(xiàn)性低等原因，使得部分林木植原體病害病原分子檢測(cè)研究具有一定難度。今后可就上述問題從以下幾方面著手：

(1)根據(jù)植原體病原濃度較低不易檢測(cè)等問題，可將采樣時(shí)間確定為溫度較高的7-8月份，另外通過發(fā)展引入RT-PCR，提高直接PCR特異性及靈敏度。

(2)應(yīng)針對(duì)不同植原體病害病原設(shè)計(jì)相應(yīng)的巢式PCR特異引物，從而減少其產(chǎn)生的假陽(yáng)性問題。

(3)就目前植原體分子檢測(cè)手段發(fā)展形勢(shì)，實(shí)時(shí)熒光PCR既能夠保證巢式PCR靈敏性同時(shí)，又可以避免假陽(yáng)性，另外還可以確定病菌濃度，因此對(duì)于林木植原體病害研究來講具有較廣的應(yīng)用前景。