怎樣做好正向間接血凝試驗

邱立新，邱美珍，杜麗飛

(1.湖南省動物疫病預(yù)防控制中心,湖南長沙 410007;2.湖南省畜牧獸醫(yī)研究所,湖南長沙 410131)

間接血凝試驗(IHA)是上世紀60年代在我國發(fā)展起來的血清學診斷技術(shù)，是用已知血凝抗原致敏與免疫無關(guān)的惰性微粒表面（載體）檢測未知血清抗體的試驗，迄今仍在許多疫病診斷中廣泛應(yīng)用。林琳等研究表明應(yīng)用豬瘟正向間接血凝法(IHA)與斑點酶聯(lián)免疫吸附試驗（dot-ELISA）以及豬瘟抗體免凝金標試紙條比較，對規(guī)模化養(yǎng)豬場138份不同階段豬血清進行檢測，三種方法檢測抗體的陽性率結(jié)果接近。數(shù)十年來正向間接血凝試驗技術(shù)不斷完善，它具有簡單、經(jīng)濟、快速、實用的特點在我國有很大的用戶群，近年來，蘭州獸醫(yī)研究所生產(chǎn)的液體豬瘟和口蹄疫正向間接血凝試驗的試劑用量在逐年加大，然而，實驗結(jié)果受操作技術(shù)影響較大。為做好正向間接血凝試驗，使各地的檢驗結(jié)果一致，減少誤差，現(xiàn)就正向間接血凝試驗談一點看法，以拋磚引玉、共同探討和提高。

1 實驗器材的優(yōu)化

本實驗所使用的實驗器材包括微量血凝板，微量振蕩器，移液器和吸頭，為保證實驗的順利進行，要選擇質(zhì)量有保障，穩(wěn)定性好的器材。

1.1 微量血凝板

實驗室經(jīng)常使用的是有機玻璃材質(zhì)110°底角的96孔V型微量血凝板，此板可以疊放，不占實驗室臺面，處理樣品量較大時合適，但每次用完需要清洗。清洗方法：一般先用清水浸泡，然后馬上用高壓清水沖洗，洗凈后用手甩干板子倒置于37℃溫箱中烘干。用前要先檢查血凝板孔底是否干凈，如發(fā)現(xiàn)有透光性差一點的孔，可用酒精棉簽擦凈。除了有機玻璃板以外，還有一次性血凝板，不需清洗，也不用擔心板子不干凈影響結(jié)果，但不能疊放，測定少量樣品適合。

1.2 微量振蕩器

使用振蕩器振蕩時間不宜超過10秒鐘，振蕩強度不能太大，先從小到大，中等強度即可。多塊板疊加后振蕩時要用手壓住最上一板，以防上下的振動造成孔中液體濺出而影響實驗結(jié)果的準確性。如果實驗室沒有它，也可用手輕拍血凝板的邊緣即可，現(xiàn)在一般用微量移液器（加樣槍），加樣后有一定的沖力，可以起到混勻的作用。

1.3 單、多道微量移液器

建議使用高質(zhì)量的移液器，用定量移液器需要準備50微升和25微升兩種。50微升的用來加稀釋液和稀釋血清，25微升的用來加血凝抗原?？烧{(diào)的移液器要選擇與檢測過程中加樣量相近量程的移液器，吸取液體時動作要輕緩，防止溶液吸入過快，沖入移液器污染柱塞或造成堵塞漏氣。一定要養(yǎng)成移液器用完后放在移液器架上的習慣，移液器如果掉到地下很容易損壞。用完后移液器用75%的酒精棉擦拭，并把刻度調(diào)到最大值。

1.4 吸嘴

高質(zhì)量的吸嘴經(jīng)過處理后可以重復(fù)使用。處理方法：吸嘴用完后浸泡在清水里，先用清水漂洗，用超聲波清洗器處理10分鐘，換水后用二層紗布包好，用洗衣機甩干，再用超聲波清洗器處理10分鐘，再用洗衣機甩干，高壓消毒滅菌器中121℃，20分鐘即可，去蓋后任水分蒸發(fā)，或放37℃溫箱中烘干。吸嘴用完后沒有用清水浸泡的很難洗干凈，不必重復(fù)使用。接觸過高感染性材料的吸嘴要高溫消毒后廢棄。經(jīng)過處理后的吸嘴如果尖頭變彎，則質(zhì)量不好，不要重復(fù)使用。

2 試劑的優(yōu)化

2.1 抗原

液體正向血凝抗原搖勻后呈咖啡色，無塊狀物沉淀，靜置后血球逐漸沉入瓶底。搖勻后能很快形成均勻混懸液的是好抗原，搖勻后仍有小塊黑色沉淀物（血球團）的抗原建議不要使用。如果只做篩檢看是否達到合格線，一瓶抗原可以檢測30到50份血清。值得一提的是液體正向血凝抗原4～8℃保存，保存期3個月，不能冷凍保存。

2.2 對照血清

陰性對照血清呈淡黃色清亮液體，陽性對照血清微紅或淡黃色略微混濁的液體。陰陽性對照血清可在-15℃到-20℃保存，有效期2年。

2.3 稀釋液

稀釋液無色透明，一般情況4～8℃保存。用前建議將稀釋液放37℃溫箱中半小時后搖勻再用較好。試劑不能放置太久，最好新進現(xiàn)用。

3 樣品血清的優(yōu)化

新分離血清盡快檢測完，未檢血清-20℃保存。冷凍血清待檢時需融化，同時避免血清反復(fù)凍融影響檢測結(jié)果。嚴重溶血、嚴重污染、腐敗或有懸浮雜質(zhì)的血清樣品不宜檢測，以免發(fā)生非特異性反應(yīng)。

4 實驗過程優(yōu)化

正向血凝實驗過程包括：加稀釋液，稀釋待檢血清，稀釋陽性陰性血清，加血凝抗原，震蕩靜置，結(jié)果判定。在試驗中要注意以下的問題：

4.1 加稀釋液

在血凝板上1～6排的1～9孔；第7排的1～4孔，第6孔；第8排的1～12孔各加稀釋液50微升。

4.2 稀釋待檢血清

取1號待檢血清50微升加入第1排第1孔，并將槍頭插入孔底，混勻后，從該孔吸取50微升移入第2孔，混勻后從該孔吸取50微升移入第3孔，直至第9孔。此時第1排1～9孔待檢血清的稀釋度（稀釋倍數(shù)） 依次為 1∶2、1∶4、1∶8……1∶256、1∶512。每個待檢血清樣品均按上述方法稀釋。在稀釋血清操作時注意不要產(chǎn)生很多氣泡，每稀釋一份血清要換吸嘴，每次試驗要做陰陽性對照，最好也做二孔空白對照，即孔中加50微升稀釋液后加25微升抗原。每次檢測時陰性、陽性和稀釋液對照只需各做一份。

4.3 稀釋陰性對照血清

在血凝板上的第7排第1孔加陰性血清50微升，對倍稀釋至第4孔。此時陰性血清的稀釋倍數(shù)依次為 1∶2、1∶4、1∶8、1∶16。第 6 孔為稀釋液對照孔。

4.4 稀釋陽性對照血清

在血凝板上的第8排第1孔加陽性血清50微升，對倍稀釋至第12孔。此時陽性血清的稀釋倍數(shù)依次為 1∶2、1∶4、1∶8……1∶2048、1∶4096。

4.5 加血凝抗原

被檢血清各孔、陰性對照各孔、陽性對照各孔、稀釋液對照孔均各加血凝抗原25微升。血凝抗原用前要充分搖勻，瓶底應(yīng)無血球沉淀。一次實驗過程應(yīng)選擇同一批號的抗原，并先從稀釋度高的孔加起，避免滴頭和孔內(nèi)的液體直接接觸。

4.6 振蕩混勻

將血凝板置于微量振蕩器上振蕩10秒鐘，如無振蕩器，用手輕輕搖勻即可。然后將血凝板放在白紙上觀察各孔紅血球是否混勻，以沒有血球沉淀為合格。蓋上玻板，室溫下或37℃下靜置2小時，判定結(jié)果，也可將板置冰箱中冷藏延至次日判定。

5 判定標準

將血凝板放在白紙上，先觀察陰性對照血清1∶16孔和稀釋液對照孔，均應(yīng)無凝集（血球全部沉于孔底形成邊緣整齊的小圓點），或僅出現(xiàn)“+”凝集（血球大部分沉于孔底，邊緣稍有少量血球凝集）。

陽性對照血清1∶2到1∶256各孔（1～8孔）應(yīng)出現(xiàn)“++”到“++++”凝集為合格（少量血球沉于孔底，大部分血球凝集）。如圖1所示，該陽性血清滴度為1∶512倍或記為9log2。

在對照孔合格的前提下，觀察待檢血清各孔，以呈現(xiàn)“++”凝集的最大稀釋倍數(shù)為該份血清的抗體效價。例如1號待檢血清1～5 孔呈現(xiàn)“++”到“++++”凝集，6～7 孔呈現(xiàn)“++”凝集，第8孔呈現(xiàn)“+”凝集，第9孔不凝集，那么就可判定該份血清的抗體效價為1∶128，或者說7log2。接種口蹄疫和豬瘟疫苗的畜群免疫抗體效價達到1∶32（即 5log2；第 5孔）呈現(xiàn)“++”凝集為免疫合格。我們不少地方作抗體篩檢時樣品血清只稀釋8個孔，加血凝抗原時只加第 3、4、5、6、7 孔，只要第5孔以上出現(xiàn)凝集的就判該血清為陽性，否則為陰性。這種方法可以大量減少試劑的用量。

6 值得探討的問題

6.1 牛病毒性腹瀉抗體干擾問題

鑒于有些場豬瘟間接血凝試驗1∶32至1∶256倍凝集的樣品與ELISA方法相比符合率不滿意，不少學者提出了間接血凝方法雖然簡單，但不能區(qū)分豬瘟抗體與牛病毒性腹瀉抗體。在實驗中如果遇到這種情況，建議采用豬瘟抗體單抗阻斷ELISA方法進行檢測，其結(jié)果更可靠些。

6.2 不同血凝板的孵育時間和判定

試劑盒要求使用110°底角的血凝板，但不少實驗室仍在使用90°底角的血凝板。如果使用的是90°底角的血凝板，結(jié)果判斷時會存在一定的差異，一般來講結(jié)果會偏低一些。在判讀結(jié)果的時間上，90°底角的血凝板判讀結(jié)果在1.5～2小時，低于1小時會判斷不準，多出現(xiàn)高判結(jié)果的現(xiàn)象。而110°底角的血凝板，判讀結(jié)果時間應(yīng)在2小時后為妥，冬天還可適當長一點，低于1.5小時會判斷不準。使用90°底角的血凝板要注意掌握好判讀結(jié)果的時間，也要注意樣品凝集圖形的梯度變化情況。如果前4個孔為100%凝集，標記為“＃”或有的標記為“++++”，第5孔為成片、塊狀的凝集，不是均勻分布，也不是多數(shù)血球沉于孔底，這時結(jié)果可以結(jié)合第4孔為100%的情況，判終點為第5孔。如果判為第4孔則判嚴了。如果是110°底角的血凝板就不存在這種情況了。第4孔和第5孔的判斷是這個試驗的關(guān)鍵，判了第4孔則該份血清為陰性，判了第5孔則為陽性，陰陽之差往往就在這一下，不能不引起重視。 □

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