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    酪酸菌培養(yǎng)條件的優(yōu)化

    2010-08-28 06:38:18李賢宇張蕊周博
    天津化工 2010年1期
    關(guān)鍵詞:酪酸菌體氮氣

    李賢宇,張蕊,周博

    (天津渤海職業(yè)技術(shù)學(xué)院,天津 300402)

    酪酸菌培養(yǎng)條件的優(yōu)化

    李賢宇,張蕊,周博

    (天津渤海職業(yè)技術(shù)學(xué)院,天津 300402)

    酪酸菌為人和動物腸道內(nèi)正常菌群中的一種有益菌,能產(chǎn)生各種維生素,對人體具有保健作用,酪酸菌的芽孢是一種較理想有開發(fā)前景的微生態(tài)制劑。制備酪酸菌微生態(tài)制劑首先要實現(xiàn)酪酸菌的高密度培養(yǎng),其次是獲得較高酪酸菌芽孢轉(zhuǎn)化率,本文對酪酸菌的培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化,取得良好的效果。

    酪酸菌;培養(yǎng)條件;優(yōu)化

    酪酸梭狀芽孢桿菌(酪酸菌),又稱丁酸菌,是1933年由日本千葉醫(yī)科大學(xué)宮入近治博士首先發(fā)現(xiàn)并報告的[1]。該菌在于土壤、酸奶、動物和人體的腸道等厭氧環(huán)境中,菌體為直或微彎曲,大小為0.6~1.2×3.0~7.0 μ,端圓,周生鞭毛,能運動。菌體中常有圓形或橢圓形芽孢,菌體中部膨大呈梭形,芽孢偏心或次端生、無芽孢外壁或附屬絲。

    酪酸菌為人和動物腸道內(nèi)正常菌群中的一種有益菌[2,3],能夠大量補充腸道內(nèi)正常菌群的數(shù)量,促進(jìn)其它有益菌群的增殖;能產(chǎn)生B族維生素、維生素K、丁酸等物質(zhì),對人體具有保健作用。并能在腸粘膜表面形成微生物屏障,阻止有害菌的定植和入侵,有效地改善腸道內(nèi)微生態(tài)環(huán)境,是一種較理想的有開發(fā)前景的微生態(tài)制劑。制備酪酸菌微生態(tài)制劑首先要實現(xiàn)酪酸菌的高密度培養(yǎng),其次是獲得較高酪酸菌芽孢轉(zhuǎn)化率,因此,使酪酸菌的培養(yǎng)濃度和芽孢轉(zhuǎn)化率均獲得較大幅度的提高。已成為研究和開發(fā)酪酸菌微生態(tài)制劑的關(guān)鍵。本文就此實驗對酪酸菌的培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化。

    1 材料與方法

    1.1 實驗材料和儀器

    菌種:酪酸菌,天津渤海職業(yè)技術(shù)學(xué)院微生物實驗室分離保藏菌種。

    主要儀器:高速離心機(北京醫(yī)用離心機廠),磁力攪拌器,氮氣鋼瓶。

    1.2 實驗方法

    1.2.1 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基

    胰蛋白胨10 g,牛肉膏10 g,酵母膏3 g,葡萄糖5 g,氯化鈉5 g,可溶性淀粉1 g,L-半光氨酸鹽0.5 g,乙酸鈉3 g,溶于1000 mL水中,調(diào)pH7.5。

    1.2.2 菌體濃度的測定

    采用活菌計數(shù)法,取1 mL發(fā)酵液加入到9 mL滅菌的生理鹽水中,依次做10倍梯度稀釋,選取三個適當(dāng)?shù)南♂尡稊?shù),吸取1 mL稀釋液注入無菌培養(yǎng)皿中,傾注法加入15 mL培養(yǎng)基混勻,每個稀釋度做三個平行培養(yǎng)皿。待培養(yǎng)基凝固后,倒置放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中,培養(yǎng)48 h。選取菌落在30~300之間的培養(yǎng)皿計菌落數(shù)。

    1.2.3 芽孢濃度的測定

    取菌液5 mL,于80℃水浴加熱10 min,殺死營養(yǎng)體細(xì)胞,然后采用上述活菌計數(shù)法計數(shù)。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 酪酸菌接種量對菌體濃度的影響

    接種量大小對培養(yǎng)結(jié)果有一定影響,接種量過大會帶入較多的種子培養(yǎng)期的代謝產(chǎn)物,并使菌體前期生長過快,從而會造成培養(yǎng)后期的代謝副產(chǎn)物大量累積,使最終菌濃有所降低;接種量過小則使菌體增殖緩慢,培養(yǎng)時間延長。

    實驗分別采用了2%、5%、10%和15%四個接種量進(jìn)行培養(yǎng),培養(yǎng)20 h后結(jié)果見圖1。由圖1可知,在培養(yǎng)20 h之后,15%接種量組已進(jìn)入穩(wěn)定期,但菌體濃度并不是最高;2%和5%接種量組仍處于指數(shù)期,生長過慢;而10%的接種量可使菌濃達(dá)到較高水平。

    圖1 接種量對菌濃的影響

    2.2 培養(yǎng)溫度對菌體濃度及芽孢轉(zhuǎn)化率的影響

    選不同的培養(yǎng)溫度進(jìn)行實驗比較,菌體的生長情況和芽孢轉(zhuǎn)化率如圖2所示。從圖2可知,酪酸菌生長的最適溫度為37℃,較高或者較低的溫度對酪酸梭狀芽孢桿菌的生長影響較大;但當(dāng)溫度低于或者高于37℃時,菌體的芽孢轉(zhuǎn)化率卻有所增加。

    圖2 培養(yǎng)溫度對酪酸菌生長及芽孢轉(zhuǎn)化率的影響

    為了在不降低菌體濃度的情況下提高芽孢轉(zhuǎn)化率,實驗采用了兩步培養(yǎng)法。首先在37℃培養(yǎng),待菌體到達(dá)穩(wěn)定期后,適當(dāng)?shù)慕档突蛘咛岣吲囵B(yǎng)溫度,芽孢的轉(zhuǎn)化率如表1所示。從表1可以看出,當(dāng)酪酸菌培養(yǎng)至穩(wěn)定期(20 h)后,溫度降至30℃繼續(xù)培養(yǎng)至32 h時,所得到的芽孢生成率可達(dá)95%;升高溫度也有利于芽孢的形成,但當(dāng)溫度高于40℃時,菌體死亡很快,最終雖然獲得的芽孢生成率較高,但由于菌體數(shù)目的大幅度減少,芽孢的總體收率降低。

    表1 20 h后改變培養(yǎng)溫度對芽孢轉(zhuǎn)化率的影響

    2.3 氮氣保護(hù)實驗

    對于專性厭氧菌——酪酸梭狀桿菌來說,對其生長造成強烈影響的是進(jìn)入三角瓶中的空氣以及該部分氣體和發(fā)酵液的混合程度。由于實驗過程中間斷性地進(jìn)行取樣,帶入空氣不可避免,為了消除這兩個方面的影響,實驗采用了氮氣保護(hù)和發(fā)酵栓同時使用的方法,實驗裝置如圖3所示。

    圖3 氮氣保護(hù)實驗裝置

    以10%接種量接種后,安裝好發(fā)酵栓,打開進(jìn)氣閥門通入氮氣,將滯留在三角瓶內(nèi)的空氣趕出,然后關(guān)閉進(jìn)氣閥(每次中間取樣結(jié)束后重復(fù)此步操作)。將培養(yǎng)裝置放入?yún)捬跸?,并開啟磁力攪拌器輕微攪拌,分別測定兩種情況下的菌體濃度:(1)每隔2 h取樣一次,培養(yǎng)20 h后測定菌體濃度;(2)培養(yǎng)過程中不取樣,培養(yǎng)20 h后測定菌體濃度。并與靜置培養(yǎng)比較,如圖4所示。

    圖4 兩種培養(yǎng)方式下菌體濃度比較

    從圖4中可以看出,靜置培養(yǎng)時,酪酸菌的菌濃要比采用發(fā)酵拴進(jìn)行氮氣保護(hù)培養(yǎng)時低得多,其主要原因是由于后者使用了磁力攪拌,使培養(yǎng)液與菌體均勻混合,促進(jìn)了菌體與培養(yǎng)液之間的物質(zhì)交換。如果每2 h取樣一次,靜置培養(yǎng)由于受進(jìn)入三角瓶內(nèi)空氣的影響,菌濃下降幅度較大;而對于氮氣保護(hù)實驗而言,整個培養(yǎng)過程中取不取樣對菌濃的影響不大。由此可見,氮氣保護(hù)實驗很好的消除了由于間斷取樣造成的氧對酪酸菌生長的危害。

    2.4 培養(yǎng)時間的確定

    將菌種接種于上述培養(yǎng)基中,依照上述培養(yǎng)條件,采用發(fā)酵栓進(jìn)行氮氣保護(hù)培養(yǎng)實驗,每隔2 h對培養(yǎng)期間的菌濃、pH值和芽孢轉(zhuǎn)化率進(jìn)行取樣測定,結(jié)果如圖5所示。從圖5可看出菌體的最高濃度出現(xiàn)在20 h;芽孢的最大轉(zhuǎn)化率出現(xiàn)在36 h,但此時由于菌體的濃度下降幅度較大,并不是芽孢的最佳收獲時期,綜合考慮,芽孢的最佳收獲時期應(yīng)在30~32 h之間。

    圖5 酪酸菌的生長曲線圖

    3 結(jié)論

    3.1 單因子實驗表明,酪酸菌的最佳接種量為10%。

    3.2 酪酸菌生長的最適溫度為37℃;但待菌體到達(dá)穩(wěn)定期后,適當(dāng)?shù)慕档团囵B(yǎng)溫度卻有利于芽孢的形成。當(dāng)酪酸菌培養(yǎng)至穩(wěn)定期(20h)后,溫度降至30℃繼續(xù)培養(yǎng)至32h時,所得到的芽孢生成率可達(dá)95%。

    3.3 對于專性厭氧菌——酪酸梭狀桿菌來說,對其生長造成強烈影響的是進(jìn)入三角瓶中的空氣以及該部分氣體和發(fā)酵液的混合程度。由于實驗過程中間斷性地進(jìn)行取樣,帶入空氣不可避免。實驗采用氮氣保護(hù)和發(fā)酵栓同時使用的方法,很好地消除了由于間斷取樣造成的氧對酪酸菌生長的影響。

    3.4 酪酸菌的生長曲線表明,細(xì)胞的最佳收獲時間為20 h、芽孢的最佳收獲時間為30~32 h之間。

    [1] 莊志發(fā),馮紫慧.簡述微生態(tài)活菌(酪酸菌)制劑的研究應(yīng)用[J].山東食品發(fā)酵,1999,(1):32~35.

    [2] John Marinko,Michael Madigan.Brock Biology of microorganisms [M].Prentice Hall,2005.

    [3] 宋會儀,吳天星.酪酸菌微生態(tài)制劑的生物學(xué)功能及在飼料中的應(yīng)用[J].飼料工業(yè),2006,27(12):10~11.

    Optimization of clostridiun butyricum culture condition

    LI Xian-yu,ZHANG Rui,ZHOU Bo
    (Tianjin Bohai Vocatinal Technical College,Tianjin 300402)

    As a beneficial bacteria,clostridium butyricum can produce a variety of vitamins,and has a health care on the human body.The spores of Clostridium butyricum are ideal microecological agents which have development prospects.Clostridium butyricum high-density culture must be carried out first before the preparation of microecological agents,followed by a higher conversion rate of butyric acid bacteria spores.Clostridium butyricum culture conditions were optimized in this paper and achieved good results.

    clostridium butyricum;culture conditions;optimization

    book=3,ebook=22

    10.3969/j.issn.1008-1267.2010.01.008

    Q839.1

    A

    1008-1267(2010)01-0022-03

    2009-10-12

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