HPLC 法測定漢中參葉中人參皂苷Rd 的含量

宋小妹 馮改利 李淵源 葛 莉 王 薇

陜西中醫(yī)學(xué)院，陜西 咸陽 712046

漢中參葉，即珠子參葉。為五加科人參屬植物珠子參Panax japonicusC.A.Mey.var.major(Burk.)C.Y.Wu et K.M.Feng的干燥地上莖葉。為陜西秦巴山區(qū)民間習(xí)用藥材，具有清熱生津、潤喉利咽、安神的功效。主要用于肺熱口渴、喉干舌燥、暑熱生津、頭暈?zāi)垦?、心煥神散疲等的治療。民間多以單葉入茶飲用,歌舞藝人常用來保護(hù)嗓音,保持體力，解暑?，F(xiàn)化學(xué)研究表明，漢中參葉富含多種人參皂苷類成分，如人參皂苷Rd、Re、Rg1、Rg2和F2，珠子參苷F1，F(xiàn)2，F(xiàn)3，F(xiàn)4，F(xiàn)5，F(xiàn)6[1-3]，此外，尚含多種氨基酸及微量元素[4]；藥理研究表明，漢中參葉總皂苷可對抗二甲苯所致小鼠耳廓腫脹，減少醋酸致小鼠毛細(xì)血管通透性增加，抑制肉芽組織增生；對熱板引起的疼痛有一定的鎮(zhèn)痛效果；能延長缺氧條件下小鼠存活時(shí)間[5-6]。為此，本實(shí)驗(yàn)采用HPLC 法建立漢中參葉中人參皂苷Rd 的含量，為客觀準(zhǔn)確評價(jià)漢中參葉藥材質(zhì)量，合理開發(fā)利用漢中參葉藥材資源提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 島津LC-2010AHT 高效液相色譜儀；Shimadzu LCsolution 工作站；SB-3200D 型超聲清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司，180w，40kHz）；BP-121S 電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)。

1.2 樣品與試劑 漢中參葉采自陜西寧強(qiáng)，經(jīng)陜西中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院中藥標(biāo)本館高級實(shí)驗(yàn)師王繼濤老師鑒定為珠子參Panax japonicusC.A.Mey.var.major(Burk.)C.Y.Wu et K.M.Feng 的干燥地上莖葉。人參皂苷Rd 對照品（中國固體制劑制造技術(shù)國家工程研究中心提供）；乙腈為色譜純（SK Chemicals 公司），水為娃哈哈純凈水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：Iner tsi l ODS-sp（5μm，4.6mm×150mm）；流動相：乙腈：水(32∶64)，檢測波長：203nm，流速：1.0ml/min；進(jìn)樣量：10μl；柱溫：30℃；理論板數(shù)按人參皂苷Rd 峰計(jì)算應(yīng)不低于3000。

人參皂苷Rd 對照品和供試品HPLC 圖譜見圖1、圖2。

圖1 人參皂苷Rd 對照品HPLC 色譜圖

圖2 漢中參葉供試品HPLC 色譜圖

2.2 對照品溶液配制 精密稱取人參皂苷Rd 對照品4.5mg，置于10ml 量瓶中，加甲醇溶解、定容，搖勻，待用。

2.3 供試品溶液的配制 取參葉粉末2g，精密稱定，置錐形瓶中，加甲醇50ml 超聲處理30min，過濾，濾液蒸干，加水分散，石油醚反復(fù)萃取，每次20ml，棄去石油醚層，再用水飽和正丁醇萃取3次（分別為20、15、15ml），合并正丁醇層，水浴蒸干，殘?jiān)蒙倭考状既芙?、并轉(zhuǎn)移定容至5ml量瓶中，備用。

2.4 線性關(guān)系考察 分別精密吸取人參皂苷Rd 對照品溶液2、5、10、15、20ul 注入高效液相色譜儀，按上述色譜條件測定，以人參皂苷Rd 進(jìn)樣量（ug）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為Y=126191X-39983，r=0.9998。結(jié)果表明，人參皂苷Rd 在9～90ug 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5 精密度考察 取同一供試品溶液，照“2.1”項(xiàng)下色譜條件，重復(fù)進(jìn)樣5次，每次10ul，測得人參皂苷Rd 峰面積的RSD 為1.7%，表明本方法精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性考察 取供試品溶液分別于0、2、4、8、12、24h 進(jìn)樣，每次10ul，記錄峰面積，計(jì)算人參皂苷Rd 的RSD 為1.8%，表明供試品溶液在24h 穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性考察 取同一批樣品5份，按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，每份進(jìn)樣10ul，測得人參皂苷Rd 含量的RSD 為0.4%，表明本方法重復(fù)性良好。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=3)

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的漢中參葉粉末約0.1g，共5份，精密稱定，分別準(zhǔn)確加入人參皂苷Rd 對照品，按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，每份進(jìn)樣10ul 測定人參皂苷Rd 的峰面積，計(jì)算平均回收率99.77%，RSD=1.67%（見表1）。

2.9 樣品測定 精密稱取漢中參葉粉末2.0g，按照供試品溶液制備方法制備樣品溶液，進(jìn)樣10ul，測定峰面積，計(jì)算含量，結(jié)果表明，漢中參葉中人參皂苷Rd 含量為0.51%（n=3）。

3 結(jié)果與討論

3.1 通過實(shí)驗(yàn)研究，建立了漢中參葉中人參皂苷Rd 的含量測定方法，實(shí)驗(yàn)過程分別對甲醇-水、甲醇-0.4%磷酸水溶液、乙腈-水等的不同配比流動相進(jìn)行了的考察，結(jié)果采用乙腈-水(32∶64)，峰與相鄰峰均能達(dá)到基線分離，且峰形較好，空白溶劑無干擾。

3.2 實(shí)驗(yàn)對提取方法、提取溶媒、提取時(shí)間等進(jìn)行了考察研究，結(jié)果表明，用甲醇溶液50ml，超聲處理30min，即能提取完全。

3.3 由于樣品為地上部分，葉綠素含量很高，因此供試品溶液的純化制備就成為本項(xiàng)的關(guān)鍵之一。實(shí)驗(yàn)過程采用了反復(fù)石油醚萃取除去葉綠素，但還不盡理想，時(shí)有柱壓過高的現(xiàn)象發(fā)生，因此，應(yīng)進(jìn)一步加強(qiáng)供試品溶液純化制備方法的研究，以保證測試結(jié)果的準(zhǔn)確穩(wěn)定。

[1]楊崇仁，伍明珠，周俊，等．珠子參葉的三萜皂苷成分[J]．云南植物研究，1984，6(1)：118-120.

[2]馮寶樹，汪夕彬，王答祺，等．秦嶺產(chǎn)珠子參葉的達(dá)瑪烷型皂甙研究[J]．云南植物研究，1987，9(4)：477-484.

[3]王答祺，馮寶樹，汪夕彬，等．秦嶺產(chǎn)珠子參葉的達(dá)瑪烷型皂甙的進(jìn)一步研究[J]．藥學(xué)學(xué)報(bào)，1989，24(8)：633-636.

[4]李映麗，呂居?jì)?，馮變玲，等．參葉-大葉三七葉中氨基酸及微量元素分析[J]．西北藥學(xué)雜志，1996，4(11)：11.

[5]姜祎，考玉萍，宋小妹．珠子參葉總皂苷抗炎鎮(zhèn)痛作用的實(shí)驗(yàn)研究[J]．陜西中醫(yī)，2008，29(6)：732，733．

[6]考玉萍，姜祎，宋小妹．珠子參葉總皂苷抗抗疲勞抗應(yīng)激作用的實(shí)驗(yàn)研究[J]．陜西中醫(yī)，2008，29(8)：1092，1093.