復(fù)方清熱顆粒對(duì)大腸埃希菌外排泵影響的研究

韓 燕 盧加河

復(fù)方清熱顆粒對(duì)大腸埃希菌外排泵影響的研究

韓 燕1盧加河2

目的觀(guān)察中藥復(fù)方清熱顆粒劑對(duì)耐環(huán)丙沙星大腸埃希氏菌外排泵耐藥機(jī)制的影響。方法建立急性耐環(huán)丙沙星大腸埃希菌腹腔感染兔模型，復(fù)方清熱顆粒藥液灌胃，空白對(duì)照組予等體積蒸餾水灌胃。末次給藥心臟取血，離心分離出含藥血清和空白血清。應(yīng)用外排泵抑制劑(CCCP)選擇出外排泵陽(yáng)性的耐環(huán)丙沙星大腸埃希氏菌，應(yīng)用瓊脂對(duì)倍稀釋法檢測(cè)在有含藥血清、空白血清、復(fù)方清熱顆粒、泵抑制劑的情況下環(huán)丙沙星對(duì)上述7株大腸埃希氏菌的MIC值變化。結(jié)果中藥復(fù)方清熱顆粒含藥血清不能明顯降低環(huán)丙沙星對(duì)大腸埃希菌的MIC值。結(jié)論復(fù)方清熱顆粒含藥血清不能改善大腸埃希氏菌對(duì)環(huán)丙沙星的耐藥情況。

大腸埃希氏菌 外排泵 復(fù)方清熱顆粒 含藥血清

1河北省滄州市中心醫(yī)院(滄州061000)

2河北省滄州市人民醫(yī)院(滄州061000)

隨著抗生素的廣泛應(yīng)用，臨床上出現(xiàn)了大量耐藥菌株，大腸埃希菌是較常見(jiàn)的一種。大腸埃希菌的耐藥機(jī)制主要有產(chǎn)生β－內(nèi)酰胺酶、藥物作用靶位的改變、外膜通透性的下降及主動(dòng)外排活躍。細(xì)菌細(xì)胞膜上存在的各種藥物外排泵在大腸埃希菌的耐藥機(jī)制中起重要的作用，大腸桿菌是發(fā)現(xiàn)外排泵最多的一種細(xì)菌，在埃希大腸桿菌上發(fā)現(xiàn)了30多種外排泵，但一般認(rèn)為AcrAB是最主要的外排泵。用基因敲除技術(shù)人工去除acrAB或tolC基因時(shí)，大腸埃希菌對(duì)上述藥物的敏感性明顯增加[1]。

1990年，革蘭陰性菌泵抑制劑研制成功[2]。外排泵抑制劑具有減少耐藥菌株的出現(xiàn)，逆轉(zhuǎn)固有耐藥和獲得性耐藥菌株耐藥性的作用[3]，成為改善細(xì)菌耐藥的希望之一。體外試驗(yàn)已經(jīng)證明，多種質(zhì)子泵抑制劑可以抑制銅綠假單胞菌、大腸埃希菌等外排泵，從而改善抗生素的抗菌活性，但因質(zhì)子泵抑制劑對(duì)人體的毒副作用過(guò)大而不能應(yīng)用于臨床。實(shí)驗(yàn)經(jīng)證明，中藥復(fù)方清熱顆?？梢砸种沏~綠假單胞菌外排泵[4]。本研究繼續(xù)觀(guān)察中藥復(fù)方清熱顆粒對(duì)大腸埃希菌外排泵的影響?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和菌株 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為健康大耳白兔4只，體重范圍2.0～2.5kg，購(gòu)自北京科宇動(dòng)物養(yǎng)殖中心;實(shí)驗(yàn)菌株為北京友誼醫(yī)院臨床分離菌株;質(zhì)控菌株為ATCC25922。

1.2 主要試劑及耗材 環(huán)丙沙星購(gòu)自拜耳公司;西黃耆膠購(gòu)自廣州南方化玻公司;復(fù)方清熱顆粒(含敗醬草、蒲公英、半枝蓮等)由北京未名天人公司提供;碳酰－氰－間氯苯腙(CCCP)，購(gòu)自Sigma公司;丙酮購(gòu)自北京化工廠(chǎng);血瓊脂培養(yǎng)皿購(gòu)自天津金章科技發(fā)展有限公司;M－H瓊脂購(gòu)自BD公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)備 電熱恒溫培養(yǎng)箱 DH6000AB型，天津市泰斯特儀器有限公司產(chǎn);光電比濁儀，美國(guó)生物－梅里埃公司產(chǎn)。

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 含藥血清的制備 兔適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，監(jiān)測(cè)呼吸頻率、心率、肛溫及體重，并觀(guān)察攝食情況。隨機(jī)分為兩組，模型組、空白對(duì)照組各2只，均禁食12h。模型組腹腔注射耐環(huán)丙沙星大腸埃希菌菌液，注射劑量2.5×109個(gè)/kg，4h后測(cè)肛溫、血常規(guī)。體溫 ＞39.5℃、白細(xì)胞總數(shù) ＞13×109/L者入選。模型組動(dòng)物均符合上述標(biāo)準(zhǔn)而入選。造模成功后每日分2次灌胃復(fù)方清熱顆粒劑藥液，劑量為22g/kg·d，連續(xù)5d。空白對(duì)照組予等體積蒸餾水灌胃，每日2次，連續(xù)5d。治療結(jié)束后禁食12h，無(wú)菌心臟采血，3000轉(zhuǎn)/s離心10min，制備含藥血清和空白血清后同組混和，－20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 外排泵陽(yáng)性大腸埃希菌的選擇 選取臨床分離的耐環(huán)丙沙星大腸埃希菌18株，各挑取單菌落平板劃線(xiàn)接種于血瓊脂培養(yǎng)皿中，36℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，再挑取單菌落，用蒸餾水稀釋?zhuān)葷醿x調(diào)節(jié)菌液至0.5麥?zhǔn)蠞舛燃s108CFU/mL。同法配制ATCC 25922菌懸液作質(zhì)控。配制含環(huán)丙沙星的瓊脂平皿，質(zhì)量濃度(μg/mL)分別為 0.125、0.25、0.5、1、2、4、8、16、32、64、128、256。細(xì)菌接種量約為105CFU。即采用瓊脂對(duì)倍稀釋法測(cè)出環(huán)丙沙星(CIP)對(duì)上述18株大腸埃希菌的MIC值[藥物敏感試驗(yàn)的操作及結(jié)果的解釋參照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)(CLSI)2006版標(biāo)準(zhǔn)]?？股貙?duì)倍稀釋瓊脂培養(yǎng)基中加入CCCP，濃度為5μg/mL(CCCP濃度依據(jù)國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)對(duì)喹諾酮類(lèi)藥物與外排泵抑制劑相互作用的研究[5－6]，該濃度對(duì)外排泵有較好抑制作用，而對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)無(wú)影響[7])。將18株大腸埃希菌菌懸液及質(zhì)控菌株菌懸液接種于含有CCCP和環(huán)丙沙星的瓊脂平皿上，接種量均為105CFU，36℃溫箱中培養(yǎng)24h，測(cè)出在有CCCP的情況下環(huán)丙沙星對(duì)上述18株大腸埃希菌的MIC值。比較兩組MIC值，如在有CCCP的情況下MIC值下降至原來(lái)的1/4或以下，即認(rèn)為該菌株為外排泵陽(yáng)性菌株[8](根據(jù)其原來(lái)MIC值大小分別命名為 E1 ～E7，見(jiàn)表 1)。

表1 應(yīng)用CCCP前后CIP對(duì)外排泵陽(yáng)性菌株MIC值的變化 (μg/mL)

2.3 外排泵陽(yáng)性菌株的藥敏結(jié)果 (1)含藥血清和空白血清MIC值測(cè)定:配制20mL含藥血清瓊脂平皿，含藥血清含量分別為0.5mL、1mL、2mL、4mL。接種上述7株大腸埃希菌菌懸液及質(zhì)控菌株菌懸液于含藥血清瓊脂平皿中，細(xì)菌接種量約為105CFU，于36℃衡溫箱培育24小時(shí)。各平皿7株大腸埃希菌均生長(zhǎng)良好。未測(cè)出含藥血清的MIC值。同樣方法亦未測(cè)出空白血清的MIC值。(2)CCCP的MIC值測(cè)定:配制含CCCP瓊脂平皿，CCCP 濃度(μg/mL)分別為 0.625、1.25、2.5、5、10、20、40、80、160、320。接種菌懸液于其中，接種量同上，于36℃衡溫箱培育24h。各瓊脂平皿上7株大腸埃希菌生長(zhǎng)良好，未測(cè)出CCCP的MIC值。(3)空白血清+CIP組、含藥血清+CIP組MIC值的測(cè)定:制備含空白血清和CIP的瓊脂平皿，每個(gè)平皿中均加入空白血清 2mL，CIP 濃度分別為(μg/mL)2、4、8、16、32、64、128。接種菌懸液于瓊脂平皿，并于36℃衡溫箱培育24h。制備含含藥血清和CIP的瓊脂平皿，分為3組，每組CIP的濃度(μg/mL)均為2、4、8、16、32、64、128。3 組平皿中含藥血清分別為 0.5mL、1mL、2mL。接種菌懸液于瓊脂平皿，并于36℃衡溫箱培育24h(CIP組、空白血清+CIP組、含藥血清+CIP組MIC值比較見(jiàn)表2)。

3 討論

大腸埃希菌細(xì)胞膜上的藥物主動(dòng)外排系統(tǒng)是導(dǎo)致大腸埃希菌對(duì)多種抗菌藥物固有或獲得性多重耐藥的重要原因[9－10]，外排泵抑制劑在臨床治療中有較好的應(yīng)用前景。

本實(shí)驗(yàn)觀(guān)察到，CIP+空白血清組MIC值較西藥組MIC值有所下降，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，說(shuō)明空白血清不能明顯改善銅綠假單胞菌對(duì)環(huán)丙沙星的耐藥情況;CIP+含藥血清組MIC值較西藥組MIC值的差異亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，說(shuō)明含藥血清也不能明顯改善大腸埃希菌對(duì)環(huán)丙沙星的耐藥情況。

此前實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明中藥復(fù)方清熱顆粒可以抑制銅綠假單胞菌的外排泵[4]，而本實(shí)驗(yàn)表明復(fù)方清熱顆粒不能對(duì)大腸埃希菌外排泵有明顯的抑制作用。通過(guò)這種相反的結(jié)果可以推斷這兩種外排泵外排環(huán)丙沙星的機(jī)制可能不同。本實(shí)驗(yàn)雖沒(méi)有取得陽(yáng)性結(jié)果，但也為外排泵抑制劑的研究提供了一些參考。

表2 應(yīng)用空白血清、含藥血清前后CIP對(duì)大腸埃希菌MIC值的變化 (μg/mL)

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The Experiment of Compound Clearing-Heat Granules on Efflux Pumps of Escherichia Coli

HAN Yan1， LU Jia－h(huán)e2
1Cangzhou Central Hospital，Hebei Province(Cangzhou 061001)
2Cangzhou People's Hospital，Hebei Province(Cangzhou 061000)

Objective:To obseve the effect of compound clearing－h(huán)eat granules on the mechanism of CIP－resistance Escherichia coli efflux pump.MethodsRabbit models were created by the acute CIP－resistant Escherichia coli abonomal infection.Those in the model group were given compound clearing－h(huán)eat granules through stomache，while the normal group were given water in the same way and the same dose.After the last giving drug， the drug serum and blank serum were separated from heart blood.7 mutants of positive efflux pump CIP－resisitance Escherichia coli were selected by CCCP.The MIC of CIP adding drug serum，blank serum， compound clearing－h(huán)eat granules and CCCP to those bacterials were measured by the agar dilution method.ResultsCompound Clearing－h(huán)eat Granules serum can not decrease the MIC of CIP to Escherichia coli.Conclusions:The resistance of the efflux pumps with the peudomonas aeruginosa could not be increased by the compound clearing－h(huán)eat granules.

Escherichia coli;efflux pump;Compound Clearing－h(huán)eat Granules;Drug serum

R285.5

A

1004－745X(2010)09－1562－02

2010－01－17)