轉錄因子 X盒結合蛋白 1轉染對神經(jīng)干細胞在缺氧環(huán)境下 grp78、EDEM表達及抗凋亡能力的影響

金鮮花, 鄭勝哲, 盧 蕾, 宋 磊

神經(jīng)干細胞(neural stem cell,NSCs)移植在神經(jīng)系統(tǒng)損傷修復和神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變的細胞替代治療以及基因治療中有著巨大的應用價值,但移植后由于缺血、缺氧的局部微環(huán)境所限,其存活能力差,自我修復作用微乎其微。因此促進細胞在非理想環(huán)境下的抗凋亡能力成為近年來神經(jīng)干細胞研究的熱點。其中最直接的方法之一是將某些抗凋亡基因通過基因工程導入干細胞中[1,2]。X盒結合蛋白 1(XBP-1)基因編碼的 xbp-1蛋白是內質網(wǎng)應激未折疊蛋白反應階段產(chǎn)生的一種重要轉錄因子[3～5],在抗凋亡途徑中起重要的保護作用[6]。本實驗將載有XBP-1基因的重組腺病毒載體轉染神經(jīng)干細胞,制造 XBP-1過表達的神經(jīng)干細胞模型,探討 CoCl2誘導的神經(jīng)干細胞缺氧模型中,過表達基因 XBP-1對移植后神經(jīng)干細胞在缺血缺氧下存活能力的影響,并探討其可能機制。

1 材料和方法

1.1 材料 健康孕 16d SD大鼠 20只,體質量220～250g,由吉林大學動物實驗中心提供(動物許可證號:SCXK(Ji)2003-0002)。重組腺病毒包裝XBP-1基因由廣州易超醫(yī)學試劑科技公司代為完成。過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG、過氧化物酶標記山羊抗兔 IgG、山羊抗兔 IgG、BSA、BCA試劑盒(武漢意德公司),CoCl2、DMSO、MTT(武漢意得公司),大鼠抗 nestin抗體(Sigma公司),FTIC標記的羊抗小鼠 IgG(Santa cruz公司),凱基 Annexin VFITC細胞凋亡檢測試劑盒(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司),FACS2Calibur型流式細胞儀(美國 B D公司),DG5031型酶聯(lián)免疫檢測儀(華東電子集團醫(yī)療裝備有限責任公司)。

1.2 神經(jīng)干細胞的分離、培養(yǎng)及鑒定 無菌條件下將 SD孕鼠脫頸處死后取出胎鼠,分離胎鼠海馬組織,用 D-Hanks液漂洗后放入冰冷 DMEM/F12培養(yǎng)液中,用眼科剪剪成約 1mm×1mm×1mm的小塊,再用吸管機械吹打至單細胞懸液,然后濾過 200目細胞篩,收集入離心管中。800r/min,離心 5min后棄上清,用 DMEM/F12(含 20ng/ml的 bFGF,2%B27,1%的谷氨酰氨,1%雙抗,20ng/ml的 EGF)2ml重新懸浮細胞后,再反復吹打制成單細胞懸液。經(jīng)細胞計數(shù)(1×106/ml)后裝入 50ml培養(yǎng)瓶中,置入37℃,5%CO2的培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。每隔 3d換半液 1次,每隔 7～10d分離傳代 1次,光學顯微鏡下觀察各時期細胞形態(tài)。取經(jīng)過二次傳代的神經(jīng)干細胞,離心 800r/min,5min后取細胞球沉淀,用少量培養(yǎng)液懸浮細球后將細胞球種植于有多聚賴氨酸包被的12孔板中,每孔加入完全培養(yǎng)基(DMEM/F12,10%FCS,P/S)1ml。6h后將懸浮培養(yǎng)的細胞團用 PBS洗 3次后用 4%多聚甲醛固定 30min。再用用 PBS洗滌 3次后分別加入一抗小鼠抗大鼠 nestin抗體(1∶100),4℃過夜,再用 PBS洗 3次,加入二抗 FTIC標記的羊抗小鼠 IgG(1∶64),37℃孵育 1h后,于免疫熒光顯微鏡下觀察。

1.3 Ad-xpb1-EGFP轉染 NSCs 將培養(yǎng)的第 2代神經(jīng)干細胞球以 1500r/min離心 5min后用DMEM/F12重懸,用吸管輕輕分吹打開使之成為單細胞懸液。計數(shù)后以每孔 2×105個細胞加入到 96孔板中。將 Ad-xpb1-EGFP病毒分為 4個不同的濃度,分別為 5×107,1×108,5×108,1×109,每個滴度加入 10孔,于 37℃,5%CO2的培養(yǎng)箱內繼續(xù)培養(yǎng)48h,定時在熒光顯微鏡下觀察細胞表達情況。挑選熒光顯微鏡下 EGFP表達最強干細胞,進一步培養(yǎng)擴增備用。

1.4 缺氧模型的構建及分組 隨機選取普通神經(jīng)干細胞分為 2組,分別記為對照組和未轉染組;隨機選取轉染后神經(jīng)干細胞設定為轉染組。每組均置于 6孔板中,設 3個復孔/組,每孔中細胞數(shù)為 5×105個?？諏φ战M中只加入培養(yǎng)液,轉染組和未轉染組中除培養(yǎng)液外還加入濃度為 150μmol/L的 CoCl 250μl構建缺氧模型。將 3組分別放入 37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育 24h。然后刮取細胞蛋白,用western blot檢測 grp78,EDEM,bcl-2,bax的含量,Annexin V/PI標記法流式細胞儀檢測各組中細胞凋亡率。

1.5 Western blot檢測目的蛋白 分別檢測對照組、轉染組和未轉染組中 grp78,EDEM,bcl-2和bax的表達,具體步驟如下:將需檢測的 NSCs懸液離心 800r/min,5min,收取細胞蛋白,加入已添加蛋白酶抑制劑的三去污細胞裂解液,冰上裂解 30min后,離心 12000r/min,20min。總蛋白濃度測定采取BCA法。每個樣品取總蛋白 15μg與 6×loading buffer 4μl混合,沸水變性 5min,行 10%SDS-PAGE凝膠電泳分離,濕轉法轉膜后,BSA加脫脂牛奶封閉膜 2h,TBST洗 6次,10min/次,加一抗(Mouse monoclonal anti-β-actine、rabbit polyclonal anti-XBP-1、rabbit polyclonal anti-grp78、rabbit polyclonal anti-EDEM、rabbit polyclonal anti-bcl-2、rabbit polyclonal anti-bax)(1∶2000)于 4℃孵育過夜,次日 TBST洗脫 6次,10min/次,再加入辣根過氧化物酶標記的二抗,室溫孵育 2h后行 ECL化學發(fā)光法顯示條帶,結果以各條帶與內參 β-actin的灰度值比值表示。

1.6 Annexin V/PI標記法流式細胞儀檢測細胞凋亡 將 3組神經(jīng)干細胞離心(2000r/min離心5min)收集,用 PBS洗滌細胞 2次 (2000r/min離心5min)收集(1～5)×105細胞,加入 Binding Buffer 500μl懸浮細胞,之后加入 AnnexinV-FITC 5μl,混勻后再加入 PropidiumIodide 5μl,混勻 ,室溫、避光 、反應 5～15min,再進行流式細胞儀檢測細胞凋亡率(%),激發(fā)波長 Ex=488nm;發(fā)射波長 Em=530nm。

2 結 果

2.1 培養(yǎng)后神經(jīng)干細胞及傳代細胞的形態(tài)觀察 原代細胞培養(yǎng)初期大部分呈近球形懸浮,邊界清楚折光度強。部分細胞相聯(lián),含少量無光澤的死細胞。培養(yǎng) 2d后逐漸形成細胞團,折光性較好,部分細胞貼壁生長。7d時細胞以神經(jīng)球形式懸浮于培養(yǎng)基中,由數(shù)個到數(shù)十個細胞組成,神經(jīng)球中央部分細胞死亡,見圖1。為防止神經(jīng)干細胞貼壁后分化,待神經(jīng)球直徑達 0.1mm左右即機械分離傳代。傳代后的神經(jīng)干細胞,仍然形成大量的神經(jīng)球。這些原代和次代神經(jīng)球形態(tài)基本相同,沒有見到明顯的分化現(xiàn)象。第二代神經(jīng)干細胞經(jīng) nestin染色后呈陽性,可見整個細胞球呈現(xiàn)綠色熒光,見圖2。

圖1 培養(yǎng) 7d時原代海馬神經(jīng)干細胞形態(tài),呈團狀生長,形成干細胞球(×200)

圖2 傳二代海馬神經(jīng)干細胞 nestin染色,細胞球呈現(xiàn)綠色熒光(×200)

2.2 獲得成功轉染的 NSCs NSCs腺病毒感染 24h即可以出現(xiàn)熒光表達,48h后表達更強,以病毒濃度為 5×108每孔時熒光表達最強,如圖3。

圖3 EGFP標記的轉染后海馬NSCs球,熒光鏡下呈強陽性(×200)

2.3 神經(jīng)干細胞中 xbp-1,grp78,EDEM,bax和bcl-2的表達 質粒 Ad-XBP1轉染神經(jīng)干細胞 48h后收取細胞蛋白,行 western blot檢測發(fā)現(xiàn)與對照組相比,轉染組神經(jīng)神經(jīng)干細胞中 xbp1含量明顯高于對照組和未轉染組(P＜0.05)。對照組與未轉染組相比,xbp1表達量沒有明顯差異,見圖4;轉染組中grp78、EDEM和 bcl-2表達量遠高于其他兩組(P＜0.05),見圖5、6、7;轉染組中 bax表達量高于對照組,但明顯低于缺氧對照組(P＜0.05),見圖8。

圖4 轉染組神經(jīng)神經(jīng)干細胞中 xbp1含量明顯高于對照組和未轉染組(*P＜0.05)。對照組與未轉染組相比,xbp1表達量沒有明顯差異

圖5 缺氧轉染組grp78含量明顯高于對照組和未轉染組(*P＜0.05)

圖6 缺氧轉染組EDEM含量明顯高于對照組和未轉染組(*P＜0.05)

圖7 缺氧轉染組bcl-2含量明顯高于對照組和未轉染組(*P＜0.01)

圖8 轉染組 bax表達量高于對照組,而明顯低于未轉染組(*P＜0.05,**P＜0.01)

2.4 流式細胞術檢測細胞凋亡 經(jīng) Annexin V/PI標記法流式細胞術檢測發(fā)現(xiàn),對照組有少量干細胞凋亡,凋亡細胞百分比為(3.37±0.04)%;缺氧轉染組神經(jīng)干細胞凋亡率為(12.85±0.05)%,明顯低于缺氧對照組(17.43±0.24)%(P＜0.05),但高于對照組(P＜0.05),見圖9。

圖9 凋亡和死亡細胞百分比(圖中右上象限代表死亡細胞,右下象限代表凋亡細胞,左下象限代表存活細胞)

3 討 論

目前認為神經(jīng)干細胞至少具備 4種特性:表達神經(jīng)上皮干細胞蛋白(neuroepithelial stem cell protein,nestin);具有自我更新和增殖能力;多潛能性,即在特定條件影響或誘導下能分化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質細胞;可塑性,在多數(shù)情況下,成體干細胞分化為與其組織來源一致的細胞,但是在某些情況下,成體干細胞的分化并不遵循該規(guī)律,表現(xiàn)出很強的跨系或跨胚層分化潛能[7]。本實驗從胚鼠海馬取材,采用機械分離法制備 NSC懸液,實驗效果比較理想。原代細胞可以自我更新、增殖,在 7～10d左右形成細胞球,并出現(xiàn)貼壁分化現(xiàn)象,經(jīng) nestin染色后表達陽性,為下一步實驗提供有效的神經(jīng)干細胞株。

腺病毒(adenovirus,Ad)是神經(jīng)干細胞基因工程中的常用載體,其特點是安全性好、穩(wěn)定,無需整合進宿主細胞基因組中,突變致癌可能性小,基因毒性低,容量較大、相對穩(wěn)定,可以插入 7.5kb的外源基因,經(jīng)得起純化、濃縮[8]。本次實驗采用 Ad攜帶XBP1基因及表達熒光蛋白的基因 EGFP轉染神經(jīng)干細胞,結果發(fā)現(xiàn)轉染后的細胞在熒光鏡下呈強陽性,說明 Ad可以成功將 XBP1導入神經(jīng)干細胞中,并且挑選轉染后熒光表達最強的干細胞株進行下一步實驗,保證了實驗的可行性和嚴謹性。XBP-1基因編碼的人 X盒結合蛋白 1(X-box binding protein 1,xbp1)是一種堿性亮氨酸拉鏈(bZIP)蛋白,為CREB/ATF轉錄因子家族中的一員[9]。它與主要組織相容性復合物第二家族(ClassⅡmajor histocompatibility complex)中的 Aa,DRa和 DPb基因的 cAMP應答元件(CRE)相互作用,與靶基因啟動子序列中的 X盒結合[10]。神經(jīng)干細胞缺血缺氧時,內質網(wǎng)腔中會有未折疊蛋白或錯誤折疊蛋白蓄積,先產(chǎn)生一種 ATF6的核內活性形式—ATF6a[11]。ATF6a通過內質網(wǎng)應激反應順式作用元件(cis-acting ER stress response element,ERSE)激活 XBP1基因。與此同時IRE1位于的內質網(wǎng)腔的結構域發(fā)生二聚化,激活胞質的蛋白激酶域,進而發(fā)生自身磷酸化作用。胞質端蛋白激酶域激活后,進一步激活特定位點羧基末端的RNase活化,從而在 XBP1-u特定的內含子和外顯子區(qū)域進行切割,產(chǎn)生具有高度轉錄活性的XBP1-s[12],表達具有活性的 xbp-1。xbp-1通過與ERSE反應元件結合誘導糖調節(jié)蛋白 78(glucoseregulated protein,grp78)的表達升高,增強內質網(wǎng)的蛋白折疊能力,通過與 UPRE反應元件結合可誘導內質網(wǎng)降解增強因子 α甘露糖苷酶樣蛋白(ER degradation enhancingα-mannosidase-like protein,EDEM)等內質網(wǎng)降解途徑相關基因的表達增多,增加泛素化蛋白酶體系對錯誤折疊蛋白的降解,減輕內質網(wǎng)腔的蛋白負荷[13,14]。與此同時,細胞也通過PERK-eif-2α途徑激活抑制蛋白質翻譯,減少蛋白質生成,降低進入內質網(wǎng)的蛋白量,避免內質網(wǎng)腔負荷進一步加重,逐步恢復細胞內穩(wěn)態(tài),減輕細胞損傷而免遭凋亡[15]。本次實驗通過 Western Blot檢測發(fā)現(xiàn)轉染組的神經(jīng)干細胞中 grp78、EDEM水平明顯高于對照組和未轉染組,說明導入的 XBP1基因可以成功過表達,并在缺氧情況下成功激活下游抗凋亡通道。并且同時發(fā)現(xiàn)過量的 XBP1表達可以引起 bcl-2水平上升,而 bax水平下降,這在既往的研究中并無相關報道。實驗最后使用流式細胞儀檢測出修飾后的 NSCs凋亡數(shù)目明顯低于未經(jīng)修飾的 NSCs組,驗證了 xbp-1抗凋亡能力的作用機制在神經(jīng)干細胞中是明確有效的。

本實驗對 XBP1過表達對神經(jīng)干細胞抗凋亡作用影響只進行了初步的研究。由于時間和條件的限制,在轉染中 Ad-XBP1質粒的濃度是否合適,轉染后細胞長期的增殖能力情況,轉染后的細胞是否具有致瘤性并沒有得到進一步的有力驗證。但實驗結果顯示 XBP1過表達可以顯著增強神經(jīng)干細胞的抗凋亡能力,可以為進一步研究使用轉染后干細胞治療神經(jīng)損傷動物模型如帕金森模型、腦梗死模型提供有力的鋪墊。

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