亞臨床動脈粥樣硬化患者血液環(huán)氧合酶-2水平研究

劉旭華，朱明慧，郭 凱

（鄭州人民醫(yī)院，河南鄭州 450003）

亞臨床動脈粥樣硬化患者血液環(huán)氧合酶-2水平研究

劉旭華，朱明慧，郭 凱

（鄭州人民醫(yī)院，河南鄭州 450003）

目的：探討亞臨床動脈粥樣硬化（AS）患者血漿中環(huán)氧合酶Ⅱ（COX-2）的活性和單個核細胞COX-2mRNA的表達水平。方法：分別應用酶聯(lián)免疫法和逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測100例亞臨床AS患者和40例健康對照血漿COX-2活性與單個核細胞COX-2mRNA表達，并結合臨床資料進行分析。結果：亞臨床AS組COX-2血漿活性水平[(10.84±3.11)U/L]明顯高于正常對照組[(6.97±1.25)U/L]，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；RT-PCR半定量分析發(fā)現(xiàn)亞臨床AS組血液中單個核細胞COX-2mRNA表達的平均吸光度（0.244 8±0.090 3）較正常對照組（0.005 8±0.002 7）顯著升高(P<0.01)。結論：COX-2血漿活性水平和COX-2mRNA的表達水平與亞臨床AS有明顯相關性，檢測血漿COX-2活性和COX-2mRNA的表達可作為亞臨床AS監(jiān)測的參考指標。

動脈粥樣硬化；環(huán)氧合酶Ⅱ；亞臨床

亞臨床動脈粥樣硬化（AS）是指有AS的易患因素,而無AS臨床表現(xiàn)的疾病發(fā)展階段。資料顯示[1]：該階段動脈內(nèi)存在活躍的低度慢性炎癥，動脈內(nèi)的輕微炎癥是一個引發(fā)刺激、損傷、愈合的反復過程，最終形成斑塊，其結果導致動脈狹窄或粥樣斑塊。環(huán)氧合酶Ⅱ(COX-2)是動脈粥樣硬化過程中重要的炎癥介質之一。RT-PCR分析表明COX-2在血管平滑肌、單核細胞、成纖維細胞均有表達，COX-2的過度表達可造成血管壁的炎癥、斑塊的不穩(wěn)定和內(nèi)膜增生。許多病理研究表明，COX-2直接參與了AS病理發(fā)生及斑快炎性反應的調(diào)控過程。筆者采用外周血測定COX-2水平和COX-2mRNA的表達，方便簡捷,能為臨床診治提供參考?，F(xiàn)報道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 亞臨床AS組 選取100例患者，其中，男62例，女38例，年齡27～82歲，平均（54.0±12.8）歲。其均為有高血壓、高血脂、長期抽煙史、糖尿病或肥胖等至少一項以上AS的易患因素但無癥狀的亞臨床AS疾病患者，或有酗酒史、心理或社會壓力大者，且超聲檢測頸動脈 IMT>1.0 mm或發(fā)現(xiàn)斑塊且無心腦腎及外周血管病變的臨床表現(xiàn)[2]。

1.1.2 健康對照組 正常對照組來自體檢健康人群，共40例，其中，男 25 例，女 15 例，年齡 32～81 歲，平均（54.5±12.3）歲，無高血壓、糖尿病及心、肺、肝、腎、腦和血液系統(tǒng)的疾病，無近期外傷手術史。全部入選對象均排除有急慢性感染、腫瘤、免疫性及變態(tài)反應性疾病。

1.1.3 標本采集 收集靜脈血5 ml EDTA抗凝，3 000 r/min離心5 min，分離血漿；淋巴細胞分離液1 500 r/min離心15 min分離單個核細胞。分別于-70℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 儀器與試劑

COX-2活性試劑盒由西班牙Cayma公司提供。ELX 800NB酶標儀由美國BIO-TEK公司生產(chǎn)。核酸分析儀DU800由美國貝克曼公司生產(chǎn)，核酸擴增儀PE9700由美國ABI公司生產(chǎn)，Trizol試劑由美國Invitrogen公司生產(chǎn)，淋巴細胞分離液由中國醫(yī)學科學院生物工程研究所生產(chǎn)，Oligo(dt)20引物及逆轉錄酶均為美國Promega公司產(chǎn)品，GELDOC-OTTS凝膠分析系統(tǒng)由美國UVP公司生產(chǎn)。

1.3 檢測方法

1.3.1 血漿活性檢測 酶聯(lián)免疫吸附雙抗體夾心法(ELISA)檢測COX-2的活性。試劑盒平衡至室溫，所有標本復溶后嚴格按試劑盒說明書在規(guī)定時間完成操作，試驗終止后酶標儀于590 nm處測得所有標本吸光度，根據(jù)試劑盒提供公式轉換成COX-2活性。

1.3.2 逆轉錄PCR檢測單個核細胞中COX-2mRNA表達Trizol試劑抽提提取單個核細胞總RNA，用核酸分析儀DU800檢測RNA濃度和純度。取2 μg總RNA，加入Oligo(dt)20引物及逆轉錄酶在25 μl體積下，行以下熱處理：30℃，10 min；42℃，20 min；99℃，5 min；4℃，5 min；最后瞬間離心。完成逆轉錄反應后，進行聚合酶鏈反應。COX-2引物序列為:上游 5′-TGAAACCCACTCCAAACACA-3′，下游 5′-TGGAACAACTGCTCATCACC-3；β-actin 引物序列為：上游 5′-CGT GACATTAAGGAGAAGCTG-3′，下 游 5′-CTCAGGAGGAGCAATGATCTTGAT-3′，均由上海生物工程公司合成。反應條件 COX-2 為：94℃，30 s；55℃，1 min；72℃，2 min；72℃，10 min，35 個循環(huán)；β-actin 為：94℃，1 min；56℃，1 min；72℃，1 min；72℃，7 min，35個循環(huán)。COX-2、β-actin的擴增產(chǎn)物分別為728 bp和375 bp。經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，利用GELDOC-OTTS系統(tǒng)對擴增產(chǎn)物條帶進行掃描，以COX-2/β-actin的吸光度(A值)作為COX-2mRNA表達的相對含量。

1.4 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 血漿COX-2活性和血液中單個核細胞COX-2mRNA表達

見表1。

表1 COX-2在亞臨床AS組與對照組中比較(±s)

表1 COX-2在亞臨床AS組與對照組中比較(±s)

與正常對照組比較，*P<0.05,**P<0.01

組別 例數(shù)（n） COX-2(U/L) COX-2mRNA(A值)亞臨床AS組正常對照組100 40 10.84±3.11*6.97±1.25 0.244 8±0.090 3**0.005 8±0.002 7

2.2 血漿COX-2活性和血液中單個核細胞COX-2mRNA表達相關性分析

直線相關分析發(fā)現(xiàn)血漿COX-2活性和血液中單個核細胞COX-2mRNA 表達之間呈正相關（r=0.791，P<0.05）。

3 討論

COX-2具有“炎癥應答基因”的特點，能引起炎癥部位的PGI2、PGE2和PGE1等的含量增加，促進炎癥反應，加重組織損傷。而COX-2誘導和表達增加又引起炎癥反應的放大和增強:COX-2可誘導血管生長因子合成，使新生血管增多而促進了粥樣斑塊病變的發(fā)生和發(fā)展[3]。Belton等[4]對42名進行外科血管重建手術的AS患者進行研究，通過免疫組化及RT-PCR方法，發(fā)現(xiàn)COX-2在AS區(qū)域表達。不僅如此，涉及AS形成過程的促炎癥反應介質，包括腫瘤壞死因子(TNF)、白細胞介素(IL)-1、干擾素(IFN)-α等炎癥因子、缺氧以及切應力刺激等，均可誘導COX-2表達[5]。文獻有關血漿COX-2活性檢測和血液中單個核細胞COX-2mRNA表達水平的研究報道并不多，本研究發(fā)現(xiàn)：在亞臨床AS階段，血液中即可檢測到低水平的COX-2表達。

亞臨床冠狀動脈粥樣硬化是指有動脈粥樣硬化的易患因素如年齡、性別、吸煙、肥胖、高血壓、高血脂、糖尿病以及胰島素抵抗等，而無冠狀動脈粥樣硬化的臨床表現(xiàn)。動脈粥樣硬化是多種心腦血管疾病的病理基礎，除了傳統(tǒng)易患因素，近年一些非傳統(tǒng)易患因素越來越引起人們的重視，如Hcy、炎癥、hs-CRP、氧化修飾脂蛋白等。已有證據(jù)表明[6]：COX作為前列腺素(PG)合成過程中的一個限速酶，在炎性反應中起重要的調(diào)控作用。當COX-2大量被誘導生成和表達時，炎性反應被放大和增強。COX-2還可誘導血管生長因子合成，使新生血管增多，促進粥樣斑塊病變的發(fā)生和發(fā)展[7]。因此降低細胞中COX-2表達是治療動脈粥樣硬化的一個關鍵環(huán)節(jié)。選擇性COX-2抑制劑可以抑制血管炎癥，因而可以減少單核細胞浸潤，延緩AS進程，增加斑塊穩(wěn)定性從而減少粥樣硬化血栓事件[8]。

表1顯示亞臨床AS組血漿COX-2活性顯著高于對照組，血液中單個核細胞COX-2mRNA表達亞臨床AS組非常顯著高于對照組。說明在亞臨床AS階段，局部炎癥部位有COX-2表達增高而釋放入血。兩種方法之間顯著相關（r=0.791，P<0.05）。相對于 COX-2mRNA 檢測，血漿中 COX-2檢測較為簡單，不需要特殊設備，可方便應用于高危人群監(jiān)測，以便臨床進行早期干預，從而可能有助于降低心血管意外發(fā)作風險[9]。

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