厄洛替尼及Survivin siRNA與非小細(xì)胞肺癌

谷 蕾，呂喜英

（1.承德醫(yī)學(xué)院08級(jí)研究生，河北承德 067000；2.承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院放化療科）

肺癌是全世界癌癥死因的首位，非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)占肺癌的80%以上。約65%的肺癌患者確診時(shí)已屬晚期，失去手術(shù)機(jī)會(huì)，最主要的治療是化療。盡管采用了手術(shù)、放療和化療等綜合治療措施，由于轉(zhuǎn)移和多藥耐藥等原因，NSCLC的5年生存率仍低于10%。NSCLC患者在使用鉑類以及紫杉醇等藥物的一/二線化療后，病情往往在較短時(shí)間內(nèi)復(fù)發(fā)；吉非替尼等三線治療方案療效亦欠佳，不能延長患者生存期。因此，迫切需要尋找新的診斷指標(biāo)和有效的治療方法。下面就厄洛替尼及RNA干擾方面敘述NSCLC的治療現(xiàn)狀。

1 表皮生長因子受體與酪氨酸激酶抑制劑厄洛替尼

1.1 表皮生長因子受體 腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移依賴于血管生成,因此，可以通過抑制血管生成來達(dá)到控制腫瘤的目的。調(diào)節(jié)血管生成的最主要的生長因子是血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)與堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bF2GF),而表皮生長因子受體(EGFR)能調(diào)控包括VEGF和bFGF[1]在內(nèi)的多種血管生成因子。EGFR屬于I型受體酪氨酸激酶超家族，具有酪氨酸激酶(TK)活性,是傳遞細(xì)胞外信號(hào)到細(xì)胞核內(nèi)的重要途徑蛋白，定位于人7p13-p12的原癌基因c-erbB1(HER1)的表達(dá)產(chǎn)物，其膜內(nèi)區(qū)包含典型的三磷酸腺苷(ATP)結(jié)合位點(diǎn)和酪氨酸激酶區(qū)。EGFR與其相應(yīng)配體表皮生長因子(EGF)、轉(zhuǎn)化生長因子α(TGF-α)等結(jié)合后，可誘導(dǎo)受體自身二聚體化，同時(shí)其胞內(nèi)酪氨酸蛋白激酶(TPK)結(jié)構(gòu)域發(fā)生磷酸化而活化，繼而激活其下游一系列級(jí)聯(lián)酶促信號(hào)傳遞系統(tǒng)。其中最主要有兩條：一條是Ras/Raf/促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)(細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶，ERK)途徑，該途徑與細(xì)胞增殖、運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞周期調(diào)控等密切相關(guān)；另一條是PI3-K/AKT途徑，與新生血管生成、抗凋亡等密切相關(guān)。EGFR在哺乳動(dòng)物上皮細(xì)胞膜表面廣泛分布。研究表明，EGFR在人類多種上皮源性腫瘤如NSCLC、結(jié)腸癌、胃癌、肝癌、頭頸部癌中過度表達(dá)，且與腫瘤的惡性程度、轉(zhuǎn)移、放化療敏感度下降及預(yù)后密切相關(guān)，因此，EGFR已成為腫瘤基因治療的一個(gè)重要靶位[2]。

1.2 酪氨酸激酶抑制劑厄洛替尼 近年來，“靶向治療”成為腫瘤治療的熱點(diǎn)。肺癌靶向治療是指應(yīng)用單克隆抗體、基因、反義寡核苷酸等特異性地作用于肺癌細(xì)胞, 在殺死肺癌細(xì)胞的同時(shí)，不殺死或極少殺傷正常細(xì)胞,又能降低宿主毒性反應(yīng)的治療藥物或方法。其中前景較好的是針對(duì)EGFR的靶向治療。目前，EGFR的抑制劑包括單克隆抗體和小分子酪氨酸激酶抑制劑。靶向EGFR的單克隆抗體是針對(duì)EGFR胞外部分的，代表藥物為西妥昔單抗(Cetuximab)等。Cetuximab是一種人鼠嵌合抗EGFR的單克隆抗體，與EGFR有很強(qiáng)的親和力，能競爭性抑制EGFR與其配體EGF和TGF-α等的結(jié)合，阻斷EGFR的激活和其下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路蛋白的磷酸化，并通過EGFR的內(nèi)吞、失活，下調(diào)其在胞膜的表達(dá)水平，還可激活抗體依賴的細(xì)胞毒作用(ADCC)，產(chǎn)生進(jìn)一步的細(xì)胞殺傷效應(yīng)。小分子酪氨酸激酶抑制劑是針對(duì)EGFR胞內(nèi)部分，代表藥物為厄洛替尼(Erlotinib)和吉非替尼(Gefitinib)等，其中以厄洛替尼為代表的EGFR抑制劑日益受到關(guān)注。厄洛替尼屬于新型的低分子量的奎哪唑啉(quinazolin)類化合物,是口服的Ⅰ型人表皮生長因子受體(HER1/EGFR)酪氨酸激酶抑制劑，用于化療方案失敗的局部晚期或轉(zhuǎn)移的非小細(xì)胞肺癌的二線治療，作用機(jī)制包括：與ATP競爭性結(jié)合EGFR的胞內(nèi)部分,抑制酪氨酸激酶的活性和磷酸化；還可誘導(dǎo)細(xì)胞周期抑制蛋白P27的表達(dá),使癌細(xì)胞阻滯于G1期,體外實(shí)驗(yàn)觀察到用藥后可誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡的發(fā)生，從而抑制腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移，降低腫瘤細(xì)胞粘附能力，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)對(duì)化療的敏感度，延長腫瘤患者生存期。厄洛替尼對(duì)患者相關(guān)癥狀具有良好的改善作用,咳嗽、呼吸困難與疼痛的改善率分別可達(dá)到44%、34%、30%[3]。厄洛替尼不良反應(yīng)發(fā)生率不高，耐受性好，主要不良反應(yīng)僅為皮疹及腹瀉，且因不能耐受不良反應(yīng)而停藥的患者比例也相當(dāng)?shù)?，提示?duì)于老年、一般情況較差的晚期NSCLC患者來說，厄洛替尼仍是有效而安全的選擇。研究顯示，厄洛替尼使患者的死亡風(fēng)險(xiǎn)下降27%,證實(shí)厄洛替尼作為EGFR TKI可以有效延長晚期NSCLC患者生存期。而與之形成鮮明對(duì)比的是另一種EGFR TKI—吉非替尼，在類似臨床研究(ISEL研究)中與安慰劑相比，對(duì)女性、腺癌、不吸煙及亞裔患者的療效較好，而對(duì)于男性、鱗癌、吸煙及非亞裔患者效果不佳。但是，厄洛替尼對(duì)吉非替尼治療效果不佳的男性、鱗癌、非亞裔以及吸煙患者亦有良好療效，并且可顯著提高其生存期。EGFR突變與化療療效無關(guān)，與EGFR TKI療效相關(guān),與總生存長有關(guān)，限制了此類藥物的臨床應(yīng)用。厄洛替尼聯(lián)合標(biāo)準(zhǔn)含鉑一線化療方案不能額外改善生存率[4]。由于最終幾乎所有的患者都會(huì)產(chǎn)生耐藥，也限制了其長期療效。EGFR抑制劑耐藥的機(jī)制主要包括以下幾個(gè)方面：酪氨酸受體高表達(dá),下游效應(yīng)蛋白活化；非依賴于EGFR的血管生成增加；下游區(qū)介質(zhì)活化，信號(hào)途徑激活以及EGFR激酶區(qū)域特異性繼發(fā)突變等。

2 Survivin與RNA干擾

2.1 Survivin與肺癌 逃避凋亡是腫瘤發(fā)生、發(fā)展和藥物抵抗的重要機(jī)制[5]。Survivin是耶魯大學(xué)Ambrosini等于1997年從人類基因庫中分選出來的1個(gè)新基因，編碼蛋白是一種胞質(zhì)蛋白，是至今發(fā)現(xiàn)作用最強(qiáng)的凋亡抑制蛋白。Survivin在細(xì)胞內(nèi)通過與聚合的微管相互作用，特異性地與caspase-3和caspase-7結(jié)合并抑制其活性，從而發(fā)揮抗凋亡作用。Survi vin也可通過p2 1間接抑制caspase。Survivin的另一個(gè)重要作用是調(diào)控細(xì)胞周期，Survivin表達(dá)具有細(xì)胞周期依賴性，只在細(xì)胞周期的G2/M期表達(dá)，與紡錘體微管結(jié)合，從而對(duì)抗凋亡。大量研究表明，Survivin高表達(dá)腫瘤細(xì)胞可耐受化療、放療，通過下調(diào)表達(dá)可增加腫瘤在化療、放療的凋亡[6]。Survivin的組織分布有明顯的選擇性，除胚胎組織外，在正常成人組織中(除胸腺和生殖腺)不表達(dá)，但是，幾乎所有惡性腫瘤組織內(nèi)均有表達(dá)，如肺癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、乳腺癌等。由于其表達(dá)的特異性及對(duì)細(xì)胞增殖和凋亡的雙重作用，使其成為肺癌基因診斷、治療和預(yù)后研究理想的靶目標(biāo)。Falleni等[7]在I期NSCLC的手術(shù)切除標(biāo)本的研究中發(fā)現(xiàn)，有96%(76/80)的標(biāo)本Survivin基因表達(dá)陽性，顯示Survivin基因在肺癌早期診斷中的價(jià)值，也是“基因沉默”治療比較理想的靶點(diǎn)[8]。針對(duì)Survivin的基因治療具有良好的靶向性、特異性和安全性，可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡并抑制其增殖，但對(duì)正常組織幾乎沒有不良影響。

2.2 RNA干擾 RNA干擾1998年由Fire首次發(fā)現(xiàn)并命名，由雙鏈RNA(dsRNA)引發(fā)的轉(zhuǎn)錄后基因沉默，又被稱為RNAi。研究發(fā)現(xiàn)RNAi可能的作用模式包括起始階段和效應(yīng)階段兩個(gè)過程。首先，加入的雙鏈RNA被切割為21-23nt的小干擾RNA(siRNA)。在效應(yīng)階段，siRNA結(jié)合一個(gè)核酶復(fù)合物，從而形成所謂的RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物(RISC)，然后借助于RNA解旋酶，并依賴于ATP將RISC激活。激活的RISC通過堿基配對(duì)定位到mRNA同源轉(zhuǎn)錄本上，并在距離siRNA37端12個(gè)堿基的位置切割相應(yīng)的靶基因mRNA[9,10]，阻斷翻譯過程，從而發(fā)揮基因沉默效果。與傳統(tǒng)的反義技術(shù)相比較，RNA干擾的作用更為強(qiáng)大[11]。RNAi具有穩(wěn)定性高、抑制作用強(qiáng)、細(xì)胞攝取相對(duì)容易等優(yōu)點(diǎn)，具有廣闊的應(yīng)用前景。目前，RNAi在基因功能、抗腫瘤和抗病毒治療等方面已被廣泛應(yīng)用。少量的雙鏈RNA分子就能完全抑制相應(yīng)基因的表達(dá)[12]。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，3'端對(duì)稱性突出2個(gè)核苷酸的約21ntRNA雙鏈復(fù)合物可以誘導(dǎo)特異的沉默效應(yīng)，稱siRNA。研究發(fā)現(xiàn)，siRNA是dsRNA發(fā)揮RNAi作用的中心環(huán)節(jié)和效應(yīng)分子。在哺乳類、人類細(xì)胞中直接導(dǎo)入人工合成的siRNA，一方面避免激活干擾素途徑，另一方面使相應(yīng)序列的靶向基因mRNA產(chǎn)生明顯的特異性抑制效應(yīng)[13]。根據(jù)這一生理機(jī)制，依照靶基因mRNA設(shè)計(jì)序列特異性siRNA，可起到封閉特異性基因表達(dá)的作用。因此，應(yīng)用靶向Survivin的siRNA技術(shù)為NSCLC的治療帶來新的生機(jī)。但RNAi體外實(shí)驗(yàn)的成功并不意味著體內(nèi)試驗(yàn)也會(huì)成功，因?yàn)闄C(jī)體內(nèi)部環(huán)境遠(yuǎn)較體外環(huán)境復(fù)雜得多，影響因素包括：給藥方式、給藥劑量、給藥頻率和藥物劑量，動(dòng)物對(duì)藥物的吸收性、敏感性、耐藥性，荷瘤動(dòng)物體內(nèi)局部和全身循環(huán)免疫狀態(tài)，藥物藥代動(dòng)力學(xué)和毒理學(xué)等。這些因素的相互影響，在一般的動(dòng)物體內(nèi)試驗(yàn)中尚未研究清楚，更何況RNA干涉這一新的實(shí)驗(yàn)方法，這方面的研究報(bào)道較少[14]，有待于作進(jìn)一步研究。

研究發(fā)現(xiàn)，在VEGF的刺激下，靜止的血管內(nèi)皮表達(dá)Survivin的能力大約可增加4倍。VEGF的抗凋亡作用主要是通過誘導(dǎo)Survivin在內(nèi)皮細(xì)胞中高表達(dá)而實(shí)現(xiàn)[7],而VEGF又是調(diào)節(jié)血管生成的最主要的生長因子之一,EGFR能調(diào)控包括VEGF在內(nèi)的多種血管生成因子,應(yīng)用厄洛替尼抑制EGFR有望降低VEGF導(dǎo)致的Survivin高表達(dá)。將厄洛替尼與Survivin siRNA結(jié)合起來用于治療NSCLC，有望提高二者的抗腫瘤效果，并對(duì)厄洛替尼治療腫瘤的作用機(jī)制進(jìn)行更深入的探討。

[1]李燕華,畢志剛.表皮生長因子受體在紫外線誘導(dǎo)血管內(nèi)皮生長因子分泌中的調(diào)控[J].南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2006,26(12):1159-1162.

[2]Hirsh FR,Witta S.Biomarkers for prediction of sensitivity to EGFR inhibitors in non-samll cell lung cancer[J].Curr Opin Oncol,2005,17(2):118-122.

[3]Herbst RS,Prager D,Hermann R,et al.TRIBUTE:A phase III trial of erlotinib hydrochloride (OSI-774)combined with carboplatin and paclitaxel chemotherapy in advanced non-small-cell lung cancer[J].J Clin Oncol,2005,23(25):5892-5899.

[4]Agelaki S,Georgoulias V.Epidermal growth factor receptor inhibitors in the treatment of non-small cell lung cancer[J].Expert Opin Emerging Drugs,2005,10(4):855-874.

[5]Reed JC.Bcl-2:prevention of apoptosis as a mechanism of drug resistance[J].Hematol Oncol Clin North Am,1995,9(2):451-473.

[6]Ikeguchi M,Liu J,Kaibara N.Expression of survivin mRNA and protein in gastric cancer cell line￡¨MKN-45￡?during cisplatin treatment[J].Apoptosis,2002,7(1):23-29.

[7]Falleni M,Pellegrini C,Marchetti A,et a1.Survivin gene expression in early-stage non-small cell lung cancer[J].J Pathol,2003,200(5):620-626.

[8]Jaattela M.Escaping cell death:survival proteins in cancer[J].Exp Cell Res,1999,248(1):30- 43.

[9]Myslinski E,Ame JC,Krol A,et a1.An unusually compact external promoter for RNA polymerase III transcription of the human H1RNA gene[J].Nucleic Acids Res,2001,29(12):2502-2509.

[10]Agrawal N,Dasaradhi PVN,Mohmmed A,et a1.RNA interference:biology,mechanism,and applications[J].Microbiol Mol Biol Rev,2003,67(4):657-685.

[11]Aoki Y,Cioca DP,Oidaira H,et al.RNA interference may be more potent than antisense RNA in human cancer cell lines[J].Clin Exp Pharmacol Physiol,2003,30(1-2):96-102.

[12]張峰,劉曄,劉三光,等.RNA干預(yù)研究及其在腫瘤基因治療中的應(yīng)用[J].中華實(shí)驗(yàn)外科雜志,2006,23(3):38l-382.

[13]Miao GY,Lu QM,Zhang XL.Downregulation of survivin by RNAi inhibits growth of human gastric carcinoma cells[J].World J Gastroenterol,2007,13(8):1170-1174.

[14]Garmell MA,Zhang L,Conklin DS,et a1.Germline transmission of RNAi in mice[J].Nat Struct Biol,2003,10(2):91-92.