鳥分枝桿菌感染流行特征和實驗室診斷研究進(jìn)展

宋 娟，劉 婷

(中國人民解放軍陸軍第八十二集團(tuán)軍醫(yī)院 檢驗病理科，河北 保定 071000)

鳥-胞內(nèi)分枝桿菌復(fù)合群(Mycobacteriumavium-intracellular complex，MAC)屬于非結(jié)核分枝桿菌(non-tuberculousmycobacteria，NTM)，近年來MAC感染在全球范圍內(nèi)呈顯著上升趨勢。鳥分枝桿菌(Mycobacteriumavium，M.avium)是MAC的主要菌株之一，于1890年首次從一只患有肺空洞疾病的雞身上分離出來，人類感染M.avium病例直到1930年才被報導(dǎo)。M.avium作為一種慢生長分枝桿菌，能夠?qū)顾拗骶奘杉?xì)胞的吞噬作用，可感染人體多個器官，導(dǎo)致肺病、淋巴結(jié)病、皮膚軟組織病、骨病、播散性NTM病等多種疾病，以MAC肺病最為常見[1]。目前M.avium感染率不斷上升，存在診斷難、治療周期長、預(yù)后差、復(fù)發(fā)率高等問題。我們對M.avium感染的流行特征和實驗室診斷進(jìn)行綜述，以期為M.avium的臨床診斷提供參考。

1 M.avium流行特征

M.avium廣泛存在于水和土壤中，并在管道中(如家庭和醫(yī)院管道)增殖。M.avium能夠合成長鏈脂肪酸(C60-C80)，構(gòu)成疏水和不滲透的外膜，在配水系統(tǒng)、醫(yī)療設(shè)備和人類氣道中形成生物膜，因此M.avium對消毒滅菌劑有較強的抵抗力和耐藥性[2]。

M.avium為條件致病菌，人類主要通過呼吸道吸入、消化道攝入、皮膚接觸來自環(huán)境中或醫(yī)療設(shè)備(未消毒或消毒不徹底)上的菌株引起感染。易感因素取決于宿主防御機制與環(huán)境中病原體暴露負(fù)荷及毒力之間的相互作用，其中機體免疫低下或免疫缺陷是M.avium感染的高危因素。研究顯示[3-4]M.avium是AIDS患者感染NTM的主要病原體，感染率超過55%?？赏ㄟ^計數(shù)AIDS患者CD4+T細(xì)胞預(yù)測是否發(fā)生M.avium感染，CD4+T細(xì)胞<100×106/L的患者NTM感染率是CD4+T細(xì)胞>100×106/L患者的9.7倍[5]，當(dāng)HIV感染者CD4+T細(xì)胞<10×106/L時，約40%的HIV感染者出現(xiàn)播散性NTM疾病[6]。除AIDS患者外，實體器官移植(solid organ transplantation，SOT)患者也是MAC感染的高危人群。2019年版《器官移植受者非結(jié)核分枝桿菌病臨床診療技術(shù)規(guī)范》指出，SOT受者人群中NTM感染率約為1.5%～1.8%，其中86%約為NTM肺病，而鳥-胞內(nèi)分枝桿菌是亞洲人NTM肺病最常見的致病菌(43%～81%)[7-8]。近年來研究發(fā)現(xiàn)γ-干擾素(IFN-γ)自身抗體免疫缺陷和白細(xì)胞介素-12(IL-12)通路遺傳缺陷亦為播散性MAC肺病的易感因素[9-10]。易感因素還包括長期使用糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑等藥物，合并糖尿病、慢性支氣管炎、腫瘤等基礎(chǔ)疾病等。

由于鑒別NTM感染較為困難，導(dǎo)致不同研究中M.avium感染率不盡相同，與實驗室診斷能力、公開報道范圍及地區(qū)差異有關(guān)。在歐洲，M.avium在意大利、丹麥、葡萄牙的感染率分別為41.5%、50.7%、58.0%，高于其它NTM菌株[11]。在美洲，M.avium在美國、巴西、阿根廷的感染率分別為54.0%、33.3%、32.2%[12]。在非洲，2016年津巴布韋由NTM引起的肺疾病中MAC占比49.4%[13]。在亞洲，2007年日本MAC感染率是5.2/100 000，到2014年已增至13.1/100 000，其中日本北部和東部以M.avium感染多見，南部和西部則以胞內(nèi)分枝桿菌多見[14]。韓國研究[15]表明M.avium感染率已占到NTM感染的88%。我國MAC感染以胞內(nèi)分枝桿菌為主，M.avium感染率相對較低。Chien等[16]報道臺灣地區(qū)M.avium感染率為15.2%，洪創(chuàng)躍等[17]報道臺灣地區(qū)M.avium感染率為22.18%，季柏林等[18]報道浙江麗水地區(qū)M.avium檢出率為16.05%，夏丹丹等[19]報道溫州地區(qū)M.avium檢出率為22.75%，李文彬等[20]報道湖南地區(qū)M.avium檢出率為12.19%，張潔等[21]報道北京地區(qū)M.avium檢出率為10.4%，周洪經(jīng)等[22]報道天津地區(qū)M.avium檢出率為9.57%，國內(nèi)M.avium感染呈現(xiàn)出南方高于北方、沿海高于內(nèi)地、氣候溫和地區(qū)高于寒冷地區(qū)的流行特點。

2 M.avium實驗室診斷

2.1 顯微鏡檢查和實驗室培養(yǎng)

在結(jié)核病高發(fā)而實驗室資源貧乏的地區(qū)，NTM感染主要通過涂片染色鏡檢抗酸桿菌的的方法進(jìn)行診斷，優(yōu)點是成本低廉、簡便快速，缺點是靈敏度低，不能對分枝桿菌進(jìn)行菌種鑒定。目前分枝桿菌培養(yǎng)仍是檢測NTM感染的金標(biāo)準(zhǔn)，來自肺內(nèi)和肺外的標(biāo)本，如痰液、支氣管沖洗液、支氣管肺泡灌洗液、肺活檢組織、淋巴結(jié)活檢組織、肝臟活檢組織、腎臟活檢組織、脾臟活檢組織、血液、骨髓分泌物、體液和糞便等均可進(jìn)行NTM培養(yǎng)。我國主要采用對硝基苯甲酸(PNB)培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)，絕大多數(shù)NTM菌種能夠在500 mg·L-1的PNB羅氏培養(yǎng)基中生長，結(jié)核分支桿菌正與之相反，但該方法培養(yǎng)時間長，一般需要10 d左右，如需繼續(xù)鑒定和藥敏實驗，時間會延長至數(shù)周。NTM生長速度、菌落形態(tài)、色素沉著和生化試驗(如煙酸、硝酸鹽測定)有助于進(jìn)一步識別MAC。盡管MAC菌落呈現(xiàn)出廣泛的菌落變異性，如從光滑到粗糙，從無色到奶油色再到亮黃色，但其它多種分枝桿菌也有此特點，菌種鑒定準(zhǔn)確性很低，需結(jié)合其他方法進(jìn)行鑒定。

需要注意的是，不同臨床標(biāo)本分離培養(yǎng)得到的NTM菌株臨床意義不同。血液、淋巴結(jié)、骨髓、肝臟、腎臟和脾臟等部位的標(biāo)本分離得到的NTM往往為致病菌，而從痰、支氣管沖洗液、肺泡灌洗液中分離得到的NTM，則需排除標(biāo)本污染或呼吸道定植的可能。應(yīng)綜合分析是否具有典型影像特點、是否符合診斷細(xì)菌學(xué)標(biāo)準(zhǔn)(痰標(biāo)本至少兩次培養(yǎng)得到鳥分枝桿菌；至少一次支氣管沖洗或灌洗培養(yǎng)得到鳥分枝桿菌；肺活檢有典型分枝桿菌病理學(xué)改變并培養(yǎng)得到鳥分枝桿菌)、是否排除其他肺部疾病(尤其是肺結(jié)核)等。

2.2 分子生物學(xué)鑒定

利用分子生物學(xué)技術(shù)可以直接從分離株或臨床樣本中提取鳥分枝桿菌的DNA進(jìn)行鑒定，快速準(zhǔn)確，是目前進(jìn)行NTM菌種鑒定的主要方法。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)是最常用的技術(shù)，NTM移動基因組元素(即插入序列，IS)可作為PCR的靶點，其中IS1311、IS900、IS901、IS1245是M.avium檢測最常用的DNA靶序列，其中以IS1245序列為探針的限制片段長度多態(tài)性分析(RFLP)是M.avium基因分型的標(biāo)準(zhǔn)方法，這一插入序列從未在其他18種常見的NTM中被識別過。此外，16S rRNA基因測序法檢測NTM快速、準(zhǔn)確，是檢測NTM比較權(quán)威的方法。熒光PCR熔解曲線法是根據(jù)不同分枝桿菌基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(intergenic transcribed spacer，ITS)片段的特異序列設(shè)計探針，采用特定的熒光通道和熔點進(jìn)行分枝桿菌鑒別的新方法，與16S rRNA基因測序法具有較高的一致性，對儀器、實驗人員要求更低，價格也更便宜，適宜臨床常規(guī)開展[23]。

近年來通過宏基因組二代測序技術(shù)(me-tagenomics next-generation sequencing，mNGS)技術(shù)診斷NTM病的報道逐漸增多，孔嬌等[24]發(fā)現(xiàn)對患者呼吸道標(biāo)本行mNGS檢測即可明確NTM病原菌種類，對肺部NTM診斷的敏感度較高，可直接鑒定菌種，但特異度較低，應(yīng)重點提高檢測特異度?？娗嗟妊芯恐赋鯷25]，mNGS在肺泡灌洗液和組織樣本中的陽性率較高，在痰液標(biāo)本檢測中的陽性率不及痰培養(yǎng)，可能與痰液中大量口咽部定植菌導(dǎo)致NTM序列檢出數(shù)量明顯下降有關(guān)，認(rèn)為mNGS檢測NTM的理想樣本為肺泡灌洗液和組織。

全基因組測序技術(shù)(WGS)是分子生物學(xué)領(lǐng)域的最新突破，可以識別物種多樣性和菌株特異性的遺傳決定因素，研究可能與NTM的抗生素耐藥性、毒性和/或宿主關(guān)系相關(guān)的多個遺傳區(qū)域。盡管WGS還未在臨床上廣泛應(yīng)用，但有可能發(fā)展成為M.avium遺傳特性鑒定的精準(zhǔn)工具。

2.3 血清學(xué)檢測

2.3.1 抗GPLs抗體檢測

血清學(xué)診斷MAC感染最常用的方法是酶免疫分析法(enzyme immunoassay，EIA)，這種方法以MAC細(xì)胞壁特有的糖肽脂類物質(zhì)(glycopeptidolipids，GPLs)核心為抗原，檢測患者血清中相應(yīng)的GPLs核心抗體。研究者通過抗體定量分析發(fā)現(xiàn)，MAC肺部感染患者血清中抗GPLs抗體(IgG、IgA和IgM)含量升高，而其他類型分枝桿菌(如結(jié)核分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌)肺部感染者和正常人群沒有這種變化，其中IgA檢測敏感性和特異性最高，分別為84%、100%。Jhun等[26]研究指出高水平的IgA表明疾病可能處于活動期，其含量變化有助于評估MAC患者的治療效果；該研究同時提出，IgA定量分析可能成為區(qū)分臨床呼吸道分離出的M.avium是感染還是定植的重要評價指標(biāo)。Matsuda等[27]研究也指出，需要治療的復(fù)雜性NTM肺病患者血清抗GPLs核心IgA抗體陽性，抗體滴度與疾病進(jìn)展高度相關(guān)。

2.3.2M.avium蛋白檢測

利用鳥分枝桿菌MAV-2054、MAV-5183、MAV-2753等蛋白抗原進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)，通過檢測血清中相應(yīng)抗體，發(fā)現(xiàn)MAC肺病患者抗MAV-2054、MAV-5183 MAV-2753的IgG抗體滴度明顯高于肺結(jié)核患者和健康對照者，認(rèn)為多重蛋白抗原聯(lián)合檢測對篩查鳥分枝桿菌肺部感染病例，特別是涂片培養(yǎng)陰性或PCR結(jié)果陰性的病例非常有價值[6]。

2.4 基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)技術(shù)

2.4.1 蛋白質(zhì)基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜

MALDI-TOF-MS蛋白質(zhì)檢測技術(shù)是通過微生物中提取的肽和蛋白質(zhì)成分獲取指紋圖譜，實現(xiàn)微生物鑒定、分型的新方法，已迅速取代傳統(tǒng)生化和表型分析鑒定方法，在臨床微生物領(lǐng)域獲得廣泛應(yīng)用，具有操作簡便、結(jié)果快速準(zhǔn)確等優(yōu)點。周亞娣等[28]利用MALDI-TOF-MS技術(shù)對NTM菌種進(jìn)行分型，與基因測序分型鑒定結(jié)果比對，發(fā)現(xiàn)MALDI-TOF-MS技術(shù)對NTM分型準(zhǔn)確率為98.4%，表明該技術(shù)在NTM鑒定中可發(fā)揮重要作用。需要注意的是，分枝桿菌細(xì)胞壁組成成分復(fù)雜且穩(wěn)定，胞內(nèi)核糖體蛋白質(zhì)難以釋放，指紋圖譜難以獲取，易導(dǎo)致分枝桿菌鑒定失敗。研究指出[29-30]，95 ℃ 30 min加熱處理，0.5 mm直徑的玻璃珠漩渦震蕩或研磨，使用改良甲酸提取等方法處理分枝桿菌均有助于細(xì)菌破壁釋放蛋白質(zhì)，提高質(zhì)譜鑒定成功率和準(zhǔn)確率。此外，目前已發(fā)現(xiàn)NTM 190余種，MALDI-TOF-MS數(shù)據(jù)庫能夠涵蓋NTM的種類將直接影響NTM鑒定結(jié)果。徐茂鎖等[31]指出MALDI-TOF-MS自建數(shù)據(jù)庫可補充商品數(shù)據(jù)庫外的預(yù)測圖譜信息，對數(shù)據(jù)庫進(jìn)行有效完善，能夠提高鑒定準(zhǔn)確率。

2.4.2 核酸基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜

MALDI-TOF-MS蛋白質(zhì)檢測技術(shù)需要進(jìn)行分枝桿菌培養(yǎng)，無法達(dá)到快速診斷的目的。而MALDI-TOF-MS核酸檢測技術(shù)以核酸作為細(xì)菌鑒定的生物標(biāo)志物，通過對多靶點基因片段進(jìn)行多重PCR特異性擴增。經(jīng)處理后的延伸反應(yīng)產(chǎn)物同質(zhì)譜基質(zhì)混合，放入質(zhì)譜儀中運行，得到獨特的指紋質(zhì)譜圖，經(jīng)過判讀后可獲得菌種及耐藥信息。已有研究[32-33]證實MALDI-TOF-MS核酸檢測技術(shù)鑒定分枝桿菌及其耐藥性，敏感度、特異度和準(zhǔn)確性都達(dá)到了較高水平，具有較好的診斷價值和臨床應(yīng)用前景。《核酸基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜技術(shù)在結(jié)核病和非結(jié)核分枝桿菌病診斷中的臨床應(yīng)用專家共識》(以下簡稱《專家共識》)指出[34]，核酸MALDI-TOF-MS技術(shù)可鑒定40個NTM菌種及其亞種，可檢測NTM大環(huán)內(nèi)酯類(阿奇霉素、克拉霉素)和氨基糖苷類藥物(卡那霉素、阿米卡星、慶大霉素)的耐藥基因型?！秾＜夜沧R》建議，對于高度疑似NTM肺病的患者，應(yīng)及早送痰和(或)支氣管肺泡灌洗液進(jìn)行MALDI-TOF-MS核酸檢測，以快速鑒定致病菌。而對于鳥分枝桿菌、胞內(nèi)分枝桿菌和膿腫分枝桿菌等致病性NTM所致NTM肺病和肺外NTM病患者，應(yīng)及早送MA LDI-TOF-MS核酸檢測技術(shù)進(jìn)行耐藥性檢測。

3 總 結(jié)

M.avium感染率高，流行特征也在不斷變化，如何進(jìn)行快速準(zhǔn)確的鑒定一直是臨床研究的重點。此外，如何識別M.avium感染風(fēng)險增加的患者，探尋篩查潛在M.avium感染的方法都是今后研究的方向。臨床和實驗室人員應(yīng)不斷加強學(xué)習(xí)，積累經(jīng)驗，積極應(yīng)對M.avium感染帶來的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。