小鼠放射性肺損傷動(dòng)物模型的建立與鑒定*

周 芊，王 東，李夢(mèng)俠，曾林立，王 閣，楊鎮(zhèn)洲

(第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所腫瘤中心，重慶 400042)

放療是胸部腫瘤最主要的治療手段之一，而放射性肺炎(radiation pneumonitis，RP)作為胸部腫瘤放療常見(jiàn)的嚴(yán)重并發(fā)癥和劑量限制因素，其發(fā)生率達(dá)5%～15%，一旦發(fā)生，通常引起嚴(yán)重的臨床后果[1]。因此，對(duì)放射性肺損傷病理過(guò)程及發(fā)生機(jī)制的研究越來(lái)越受到各國(guó)學(xué)者的重視，建立一種合適的放射性肺炎動(dòng)物模型以及穩(wěn)定、準(zhǔn)確的鑒定方法是進(jìn)一步深入研究所必須的。為此，本研究建立了放射性肺損傷小鼠動(dòng)物模型，并對(duì)模型進(jìn)行了病理組織學(xué)和血清學(xué)鑒定，為今后研究放射性肺損傷防護(hù)提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 體質(zhì)量17～21 g成年健康雌性昆明小鼠72只，購(gòu)自第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。數(shù)字化直線加速器(瑞典ELEKTA公司)、普通光學(xué)顯微鏡(BX-50，Olympus，日本)、蛋白核酸分析儀(美國(guó)Bio-Rad公司)、5804型臺(tái)式冷凍離心機(jī)(德國(guó) Eppendorf)、PROTEAN Ⅱ中型垂直電泳儀(美國(guó) Bio-Rad公司)、TGF-β1小鼠單抗試劑盒(美國(guó) Biosource)等。

1.2 全胸照射方法 速眠新Ⅱ(1.5 mg/kg)肌肉注射，全身麻醉小鼠，將小鼠仰臥位固定于治療床上，以5 mm鉛板防護(hù)動(dòng)物頭部和腹部。照射組小鼠使用直線加速器產(chǎn)生的8 m V X射線，經(jīng)前胸野單次照射小鼠肺臟中平面 20 Gy，劑量率為200 cGy/min，動(dòng)物與放射源距離為100 cm，射野范圍為10 cm×10 cm。對(duì)照組小鼠給予麻醉后佯裝照射。

1.3 鼠肺大體標(biāo)本觀察 于照射后1、3 d和1、2、4、8周6個(gè)時(shí)相點(diǎn)麻醉小鼠，先結(jié)扎氣管再剖開(kāi)胸腔分離主氣管，并快速將氣管及雙肺剝離出胸腔，觀察肺的大體結(jié)構(gòu)改變。

1.4 組織病理學(xué)觀察 選取小鼠右肺組織予10%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋切片，作HE染色和利用M asson三聯(lián)染色(肺組織膠原纖維染色)評(píng)價(jià)肺組織切片纖維化程度，光鏡觀察病理組織結(jié)構(gòu)改變。

1.5 酶聯(lián)免疫(ELISA)法檢測(cè) 于照射后1、3 d和1、2、4、8周6個(gè)時(shí)相點(diǎn)，每組取3只小鼠眼靜脈血1.5～2 m L，25℃下放置30 min，4000 r/min離心5 min，取血清0.5 m L置于1.5 m L聚丙二醇試管內(nèi)，血清轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF-β1)含量測(cè)定按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。用包被緩沖液稀釋兔抗鼠IgG單克隆抗體包被酶標(biāo)板，稀釋度分別為1∶5000、1∶10000、1∶20000、1∶40000，每一濃度包被 3個(gè)縱行，每孔100μL，4 ℃過(guò)夜，每孔均作復(fù)孔。次日，將酶標(biāo)板洗滌3次，5%BSA封閉，每孔200μL，37℃孵育2 h，洗滌3次。在橫行包被孔中依次加入陰性對(duì)照血清，弱陽(yáng)性抗原液及強(qiáng)陽(yáng)性抗原液，每孔100μL，37℃孵育1 h，洗滌3次。在每一包被濃度的一個(gè)縱行中分別加入按1∶2000、1∶5000、1∶10000稀釋的上述多克隆抗體，每孔100μL，37℃孵育1 h，洗滌3次。在每一包被濃度的一個(gè)縱行中分別加入按1∶5000稀釋的HRP標(biāo)記羊抗兔IgG抗體，每孔 100μL，37℃孵育45 min，洗滌3次。加 TMB底物，室溫避光顯色 15～20 min，用2 mol/L H2SO4終止反應(yīng)，讀取OD450值。以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)血清樣品的OD值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其濃度。

2 結(jié) 果

2.1 大體觀察 小鼠全肺照射后4周，照射野內(nèi)被毛明顯脫落。解剖標(biāo)本顯示:對(duì)照組小鼠肺臟外觀呈粉紅色，表面光滑，彈性良好;照射組肺臟輕度腫脹、充血，表面和切面可見(jiàn)散在出血點(diǎn)，照射后8周全肺呈暗紅色。

圖1 小鼠肺照射后組織形態(tài)學(xué)改變(HE×400)

圖2 小鼠肺組織Masson三聯(lián)染色顯示肺組織受照射后膠原纖維的變化(M asson×400)

2.2 HE染色和Masson染色組織學(xué)觀察 對(duì)照組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)正常，肺間質(zhì)未見(jiàn)充血，毛細(xì)血管壁完整，肺泡及細(xì)支氣管腔無(wú)炎性滲出，見(jiàn)圖1A。而照射組小鼠肺組織照射后1、3、7、14 d病變以滲出為主，肺間質(zhì)及肺毛細(xì)血管充血、水腫，肺泡腔及細(xì)支氣管內(nèi)見(jiàn)較多的淋巴細(xì)胞，間質(zhì)水腫致肺泡壁輕度增厚，部分肺泡間含水腫液，見(jiàn)圖1B。照射后4、8周病變以慢性炎癥為主，支氣管和血管周?chē)梢?jiàn)以淋巴細(xì)胞為主的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡壁增厚，肺泡腔變小，肺泡間隔及部分肺泡腔內(nèi)可見(jiàn)纖維素樣滲出物，見(jiàn)圖1C。Masson三聯(lián)染色:可見(jiàn)肺間質(zhì)藍(lán)色膠原纖維沉積，對(duì)照組可見(jiàn)少許纖維組織，見(jiàn)圖2A;照射組照射后2周纖維組織開(kāi)始增生，見(jiàn)圖2B，照射后4、8周肺纖維化形成，肺結(jié)構(gòu)紊亂，并可見(jiàn)大量染成綠色的膠原纖維，見(jiàn)圖2C、D。

2.3 血清 TGF-β1檢測(cè)結(jié)果 照射后 1周血清 TGF-β1含量明顯增高，此后逐漸增高，第8周達(dá)高峰，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，見(jiàn)圖 3。

圖3 各組小鼠血清TGF-β1含量檢測(cè)

3 討 論

放射性肺損傷動(dòng)物模型建立對(duì)進(jìn)一步研究放射性肺損傷機(jī)制及防治至關(guān)重要。綜合遺傳背景、操作難易程度、費(fèi)用等因素，由于小鼠體積小、成本低，易于建立并方便快捷，目前認(rèn)為建立放射性肺損傷鼠類(lèi)動(dòng)物模型比較適合且應(yīng)用最為廣泛。本研究應(yīng)用昆明小鼠建立了放射性肺損傷模型，該小鼠特點(diǎn)是抗病力和適應(yīng)力強(qiáng)、成活率高。

放射性肺損傷與照射劑量、受照體積和部位等因素相關(guān)，研究者可根據(jù)研究目的來(lái)選擇照射劑量。進(jìn)行放射肺損傷的長(zhǎng)期效應(yīng)研究，國(guó)外有學(xué)者給予4 Gy或7 Gy單次照射小鼠肺組織，應(yīng)用呼吸頻率和致死率來(lái)評(píng)價(jià)1年后放射性肺損傷，也有研究者采用13.5 Gy單次照射小鼠并持續(xù)觀察24周[1-2]。楊明會(huì)等[3]報(bào)道對(duì)比大鼠一次性給予30 Gy或3 Gy、每周2次、總劑量30 Gy的照射，組織學(xué)證實(shí)兩組均能引發(fā)典型的放射性肺炎和肺纖維化，但26周后發(fā)現(xiàn)小劑量多次照射組大鼠存活率高。對(duì)放射肺損傷進(jìn)行短期研究，目前多采用大分割單次照射法。孟玲玲等[4]采用6 m V X線單次照射小鼠右肺30 Gy，觀察至照射后2個(gè)月。雖然小劑量多次照射被認(rèn)為更符合臨床常規(guī)治療劑量，但目前大家也逐步開(kāi)始關(guān)注全身立體定向治療時(shí)的大分割照射，故在本實(shí)驗(yàn)中仍采用20 Gy全肺單次照射構(gòu)建放射性肺炎模型。本研究結(jié)果表明，通過(guò)全肺20 Gy單次照射雌性昆明小鼠，成功地復(fù)制出典型的放射性肺炎小鼠動(dòng)物模型。

國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究認(rèn)為放射性肺損傷的病理形態(tài)學(xué)改變主要是肺間質(zhì)充血水腫，肺泡內(nèi)滲出物增加，炎細(xì)胞浸潤(rùn)，后期纖維結(jié)締組織增生，肺泡萎縮[5-6]。本研究結(jié)果基本與之相符，照射組2周內(nèi)以滲出為主，4周后病變以慢性炎癥為主，肺泡間隔及部分肺泡腔內(nèi)可見(jiàn)纖維素樣的滲出物。因而，通過(guò)病理觀察證實(shí)本放射性肺炎小鼠模型成功建立。目前比較認(rèn)同的放射性肺損傷發(fā)生的機(jī)制為放療產(chǎn)生的活性氧直接作用于實(shí)質(zhì)細(xì)胞并通過(guò)改變細(xì)胞因子的微環(huán)境而啟動(dòng)一系列的“分子級(jí)聯(lián)”反應(yīng)，隨著活性氧自由基的增多，導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化、DNA和蛋白質(zhì)的氧化以及致炎因子的進(jìn)一步激活，最終導(dǎo)致纖維化形成[7-8]。國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)這些生物因子進(jìn)行了大量研究，目前比較一致的觀點(diǎn)認(rèn)為血清TGF-β1水平可以作為放射性肺損傷的預(yù)測(cè)因子，與急性放射性肺炎尤其是放射性纖維化密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)放療后小鼠血清TGF-β1含量呈現(xiàn)逐漸升高過(guò)程，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，這與Machtay等[2]研究結(jié)果類(lèi)似，只是在發(fā)生改變所對(duì)應(yīng)的時(shí)相點(diǎn)和含量的高低上有所差別。

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