PCR法鑒定結核分枝桿菌復合群亞種的研究

汪小黎 崔振玲 王潔 陸俊梅 胡忠義

(1.蘇州大學基礎醫(yī)學與生物科學學院 蘇州 215123;2.同濟大學附屬上海市肺科醫(yī)院上海市結核病(肺)重點實驗室 上海 200433)

結核分枝桿菌復合群中各菌型致病性和藥物敏感性不盡相同,在臨床治療前需要進行菌種鑒定,目前臨床使用的生化方法耗時長,給治療帶來不便,本研究采用PCR法可快速鑒定結核分枝桿菌復合群亞種,具有快速、準確的優(yōu)點,現(xiàn)將研究結果報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 人結核分枝桿菌標準株(H37Rv,CMCC(B)95053)和牛結核分枝桿菌標準株(CMCC(B)93006),非洲分枝桿菌標準株(M.africanum,CMCC(B)95049)購自國家菌種保存中心。19株牛結核分枝桿菌分離株(M.bovis),PNB培養(yǎng)生長試驗陰性,TCH培養(yǎng)生長試驗為陰性;20株人結核分枝桿菌分離株(M.tb),PNB培養(yǎng)生長試驗陰性,TCH培養(yǎng)生長試驗陽性。

1.1.2 試劑 羅氏培養(yǎng)基,參照文獻[1]制作;液體培養(yǎng)基為米氏7H9培養(yǎng)基(含10%OADC營養(yǎng)添加劑),購自Difco公司;硝基苯甲酸(PNB)、2-羧酸肼噻吩(TCH)購自sigma公司;基因組抽提裂解液為優(yōu)化堿裂解法配方,是本實驗室自制;引物及探針合成由上海生物工程公司完成;PCR所有試劑購自TAKARA公司;硝酸纖維薄膜,購自Amersharn公司;其他試劑購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1 PCR鑒定法 參照文獻[2]針對16S rRNA、Rv0577、IS1561、Rv1510、 Rv1970、Rv3877/8、Rv3120設計引物進行PCR擴增。在此基礎上,針對M.bovis RD4區(qū)缺失的特點,在缺失片段兩端設計一對新引物RD4-sense：5′-cccgcactgaccatgccattt-3′,RD4-antisense：5′-cgcaaggacctgttcaccaa-3′,M.bovis擴增后的目的條帶為881 bp,M.tb擴增后的目的條帶為2801 bp。PCR擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.2.2 生物化學方法

1.2.2.1 PNB和TCH試驗參照文獻[1]操作。

1.2.2.2 TCH的MIC值測定 用液體培養(yǎng)基將TCH倍比稀釋至0.0625μg/ml,0.125μg/ml,0.25μg/ml,0.5μg/ml,1.0μg/ml。MIC 檢測方法參照文獻[3]。

1.2.2.3 硝酸還原酶實驗 按照參考文獻[1]操作。

1.2.3 Spoligotyping檢測 參考文獻[4]操作。

2 結果

2.1 PCR法鑒定結果

2.1.1 7對引物鑒定結果 39株臨床分離菌株電泳結果一致(圖1d)。

2.1.2 優(yōu)化PCR鑒定結果 8對引物PCR聯(lián)合鑒定,39株臨床分離菌株電泳結果一致(圖2d)。

2.2 生化鑒定結果 生化鑒定結果見表1。

2.3 TCH的MIC檢測結果 牛結核標準株MIC值為0.5μg/ml,5株TCH選擇培養(yǎng)基陰性臨床分離株和H37Rv標準株的MIC值均≥1.0μg/ml。

圖1 PCR鑒定結果圖

圖2 優(yōu)化PCR鑒定結果圖

表1 39株臨床分離株及牛結核標準株,H37Rv生化鑒定結果a

表2 Spoligotyping檢測結果

2.4 Spoligotyping檢測結果 39株臨床分離株及H37Rv,牛結核標準株,非洲分枝桿菌標準株Spoligotyping檢測結果見表2。

3 討論

目前臨床常用生化方法鑒定結核分枝桿菌復合群的方法存在時間長,無法準確鑒定的缺點,本研究用生化方法檢測結果顯示重復性差。為此本研究在已有PCR鑒定基礎上,進一步改良優(yōu)化,建立了新的PCR鑒定結核分枝桿菌復合群亞種的方法。

7對引物PCR鑒定結果分析顯示39株待檢菌株均非M.bovis,與M.tb標準株結果一致。M.tb和M.bovis是結核分枝桿菌復合群中臨床最常見的2種,且根據(jù)已有報道[5]推測臨床標本中不排除2種菌株同時存在的可能,但7對引物聯(lián)合鑒定法中由于牛結核分枝桿菌無特異特征條帶,無法檢測出混合菌株中的牛結核菌株。針對此缺陷,本研究根據(jù)M.bovis缺失RD4片段的特點,在RD4片段兩端設計引物進行PCR擴增。目前Spoligotyping技術已大量應用到結核分枝桿菌復合群亞種鑒定[6-8],本研究Spoligotyping檢測結果顯示39株待檢菌株均非M.bovis,與上述PCR擴增鑒定法結果一致,顯示可有效鑒定人?；旌暇?。

我國臨床分離的結核分枝桿菌復合群主要為M.tb和M.bovis,本研究結果顯示優(yōu)化后的PCR法可有效鑒定結核分枝桿菌復合群亞種,且與常規(guī)生化鑒定方法相比準確性較高,操作簡便快捷,具有較好的應用前景。

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