GCMS法測(cè)定動(dòng)物組織中鹽酸克倫特羅前處理方法的研究

俞慧紅

摘要[目的]建立一種簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、快速而又重現(xiàn)性好的氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（GCMS）測(cè)定動(dòng)物組織中鹽酸克倫特羅的預(yù)處理方法。[方法]以豬肝為原料，預(yù)處理方法是樣品在堿化的條件下用乙酸乙酯提取，用酸性水溶液反萃取，SCX固相萃取小柱凈化，經(jīng)雙三甲基硅烷三氟乙酰胺（BTSFA）衍生后，再采用氣質(zhì)聯(lián)用儀進(jìn)行檢測(cè)其鹽酸克倫特羅的含量。[結(jié)果]研究顯示，該方法下鹽酸克倫特羅的回收率為85%～95%，檢出限可達(dá)0.5 μg/kg。[結(jié)論]采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定動(dòng)物組織中鹽酸克倫特羅的精密度高，重現(xiàn)性好，方法可靠。

關(guān)鍵詞鹽酸克倫特羅；動(dòng)物組織；預(yù)處理；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法

中圖分類號(hào)S851.34+7文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2016）04-130-03

Pretreatment of Clenbuterol Hydrochloride in Animal Tissue Detection by GCMS Method

YU HuiHong （Food and Drug Inspection and Testing Center of Cixi City，Cixi，Zhejiang 315300）

Abstract [Objective] To establish a simple，accurate，rapid and repeatable GCMS method，which was a pretreatment method to detect the clenbuterol hydrochloride in animal tissues.[Method] With pig liver as the raw material，extraction was carried out in alkaline condition by ethyl acetate.Acidic aqueous solution was used for backextraction.After purification by SCX solid phase extraction column，and derivation by doubletrimethylsilyl trifluoroacetamide （BTSFA），GCMS was used for detection.[Result] The recovery rate of clenbuterol hydrochloride was 85%95%； and detection limit reached 0.5 μg/kg.[Conclusion] Detecting clenbuterol hydrochloride in animal tissues by GCMS has high precision，good repeatability and reliable results.

Key wordsClenbuterol hydrochloride； Animal tissue； Pretreatment； GCMS

鹽酸克倫特羅（Clenbuterol，CLB），其化學(xué)名為羥甲叔丁腎上腺素或2[（叔丁氨基）甲基]4氨基3，5二氯苯甲醇鹽酸鹽，藥品名為雙氯醇胺、克喘素、氨哮素。它是強(qiáng)效選擇性β2受體激動(dòng)劑，有強(qiáng)而持久的松弛支氣管平滑肌的作用，將其添加于飼料中，能促進(jìn)家畜生長(zhǎng)，減少酮體脂肪沉積，提高瘦肉率，故又稱“瘦肉精”。但食用含鹽酸克倫特羅較高的動(dòng)物組織后，人體會(huì)出現(xiàn)肌肉顫動(dòng)、肌痛、心動(dòng)過(guò)速，甚至惡心、頭暈?zāi)垦５戎卸景Y狀[1]。

目前，鹽酸克倫特羅的檢測(cè)方法已經(jīng)比較成熟，我國(guó)現(xiàn)有的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)主要有國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 5009.192-2003《動(dòng)物性食品中克倫特羅殘留量的測(cè)定》[2]、農(nóng)業(yè)部推薦性標(biāo)準(zhǔn)NY/T 468-2006《動(dòng)物組織中鹽酸克倫特羅的測(cè)定氣相色譜/質(zhì)譜法》[3]，檢測(cè)方法主要集中在酶免疫分析法、高效液相色譜法、氣質(zhì)聯(lián)用儀法等。無(wú)論采用哪種方法，前處理的技術(shù)要求很高，檢測(cè)過(guò)程繁瑣，難于操作，容易出差錯(cuò)，要求檢測(cè)人員專業(yè)性強(qiáng)且具有豐富的實(shí)際操作經(jīng)驗(yàn)[4]。樣品的前處理技術(shù)得當(dāng)與否，將直接影響測(cè)定試驗(yàn)結(jié)果。我國(guó)一般將酶免疫分析法作為篩選法，液相色譜法作為半確證法，氣質(zhì)聯(lián)用法作為確證和仲裁方法，因此，筆者針對(duì)氣質(zhì)聯(lián)用法中樣品前處理過(guò)程的注意事項(xiàng)展開了討論，以期得到更加準(zhǔn)確、有效的檢測(cè)數(shù)據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1原料樣品。豬肝，購(gòu)于慈溪滸山菜市。

1.1.2主要試劑。鹽酸克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)品（純度99.2%），德國(guó)DR公司；雙三甲基硅烷三氟乙酰胺（BTSFA）衍生劑，阿拉丁公司；SCX小柱（500 mg，3 mL），美國(guó)安捷倫公司；甲醇、甲苯、乙酸乙酯為色譜純?cè)噭?，美?guó)天地公司；鹽酸、氫氧化鈉、碳酸鈉、氨水、甲醇均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)；高純氦氣（99.99%），上海浦江特種氣體有限公司；水為超純水，由優(yōu)普超純水制造系統(tǒng)制備。

1.1.3主要儀器設(shè)備。7890A5975C氣質(zhì)聯(lián)用儀、固相萃取儀，美國(guó)安捷倫公司；電子天平（0.01 mg），瑞士梅特勒公司；電子天平（0.01 g），美國(guó)賽多利斯公司；T18勻質(zhì)器、MS3漩渦混合器，德國(guó)IKA公司；真空泵，天津奧特賽恩斯儀器有限公司；HSC24A氮吹儀，南京科捷分析儀器有限公司；DGG9240B烘箱，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；TGL20W離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司。

1.2方法

1.2.1標(biāo)準(zhǔn)溶液配制。標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備溶液：稱取鹽酸克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)品50.40 mg（有效濃度99.2%，折算后有效成分為50.00 mg），用甲醇定容至50 mL容量瓶，配成1.0 mg/mL鹽酸克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。

標(biāo)準(zhǔn)品中間溶液：吸取1 mL上述標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備溶液用甲醇定容至100 mL，稀釋得到濃度為10 μg/mL鹽酸克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)溶液，同樣方法，稀釋得到200 μg/L鹽酸克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)溶液。

標(biāo)準(zhǔn)溶液系列：各吸取100 μg/L鹽酸克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)溶液0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 mL，用甲醇定容至10 mL容量瓶，分別配成4、10、20、40、100 μg/L鹽酸克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.2儀器條件。氣相條件：色譜柱HP5MS（30 m×250 μm×0.25 μm）；進(jìn)樣口溫度280 ℃；柱流量1.0 mL；柱溫程序?yàn)?20 ℃保持3 min，10 ℃/min升至230 ℃，保持10 min，25 ℃/ min升至270 ℃，保持5 min；不分流進(jìn)樣；進(jìn)樣體積1 μL。

質(zhì)譜條件：傳輸線溫度280 ℃；離子源溫度230 ℃；EI電壓70 eV；容積延遲5 min；選擇特征離子m/z86、m/z212、m/z262、m/z277；定量離子m/z86。

1.2.3樣品處理及分析。

1.2.3.1樣品提取步驟。稱取經(jīng)處理后的豬肝臟組織樣品5.00 g于第1支帶蓋50 mL塑料離心管，加15 mL乙酸乙酯，再加入3 mL 10.0%碳酸鈉溶液，10 000 r/min以上高速勻漿1 min，蓋上蓋子放入離心機(jī)以5 000 r/min的速度離心5 min；勻漿機(jī)轉(zhuǎn)子上會(huì)粘有很多樣品殘?jiān)?，再用?支裝有10 mL乙酸乙酯的塑料離心管繼續(xù)以10 000 r/min高速勻漿1 min；取出離心好后的第1支塑料離心管，吸取上層有機(jī)溶劑于第3支塑料離心管；將第2支塑料離心管中10 mL乙酸乙酯加入第1支塑料離心管樣品殘?jiān)校鰷u混合器上混合1 min，5 000 r/min離心2 min，將上層有機(jī)溶液合并到第3支塑料離心管中；在收集的有機(jī)溶液中加入5 mL 0.10 moL/L的鹽酸溶液，漩渦混合儀混合30 s，再以5 000 r/min的速度離心2 min，吸取上層有機(jī)溶液至第4支塑料離心管；在第4支塑料離心管加入5 mL 0.10 moL/L的鹽酸溶液，漩渦混合儀混合30 s，再以5 000 r/min的速度離心2 min，吸取上層有機(jī)溶液將其棄去；合并第3支和第4支離心管下層水相。

1.2.3.2樣品凈化處理。SCX小柱依次用5 mL甲醇、5 mL純水、5 mL 30 mmoL/L鹽酸活化，控制流速1 mL/min，棄去流出液；將上述提取液上樣至固相萃取小柱，棄去流出液；上樣完畢，再依次用5 mL純水和5 mL甲醇淋洗柱子，棄去淋洗液，并將小柱抽干；再用5 mL 4%氨化甲醇進(jìn)行洗脫，用帶蓋的玻璃離心管收集洗脫液。上樣時(shí)要特別注意控制過(guò)柱流速，最好在自身重力作用下自流，如果過(guò)柱過(guò)程中遇到堵塞，可以適當(dāng)加壓，控制流速最好不要超過(guò)1 mL/min。根據(jù)NY/T 468-2006標(biāo)準(zhǔn)方法，樣品提取液需回調(diào)pH至5.2，但對(duì)于SCX小柱來(lái)說(shuō)，可以不用回調(diào)pH。因?yàn)镹Y/T 468-2006標(biāo)準(zhǔn)中采用的硅膠基質(zhì)的強(qiáng)陽(yáng)離子交換小柱，硅膠在pH 2.0～7.5穩(wěn)定，而SCX小柱填充的聚合物基質(zhì)則在pH 1.0～14.0中均穩(wěn)定存在。經(jīng)過(guò)測(cè)試，SCX商品小柱不經(jīng)過(guò)調(diào)整pH至5.2結(jié)果回收率也很好，都保持在85%～100%，而且還避免了調(diào)pH反復(fù)用酸度計(jì)測(cè)定時(shí)引起樣液損耗而帶來(lái)的影響。

1.2.3.3樣品衍生化。上述洗脫液在50 ℃水浴中氮吹至干，加入100 μL甲苯和100 μL硅烷化試劑雙三甲基硅烷三氟乙酰胺（BSTFA），試管加蓋后于漩渦混合儀混合30 s，放于預(yù)熱好的80 ℃烘箱衍生1 h，烘箱應(yīng)該預(yù)先加熱至所定溫度80 ℃。同時(shí)吸取鹽酸克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)溶液系列（4、10、20、40、100 μg/L）各0.5 mL到裝有4.5 mL 4%氨化甲醇溶液帶蓋的玻璃離心管中，50 ℃水浴中氮吹至干，同樣操作放烘箱衍生，處理好的樣液和標(biāo)準(zhǔn)系列溶液去衍生時(shí)，要注意同步進(jìn)行，盡量避免衍生條件不一致。衍生完畢后，取出冷卻至室溫，加入0.3 mL甲苯，在漩渦混合儀振蕩30 s，轉(zhuǎn)移至進(jìn)樣小瓶中，進(jìn)行氣相色譜-質(zhì)譜分析。衍生后樣液如果有殘?jiān)?，建議用0.22 μm有機(jī)濾膜進(jìn)行過(guò)濾至小樣品瓶再上機(jī)分析。

2結(jié)果與分析

2.1方法線性關(guān)系、檢出限的測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)品鹽酸克倫特羅經(jīng)氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（GCMS）的分析結(jié)果見圖1和圖2。

2可知，在該試驗(yàn)方法的條件下，所有試劑對(duì)檢測(cè)均無(wú)干擾，鹽酸克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)品在GC色譜圖中出峰保留時(shí)間為12.978 min，其特征離子為m/z86、m/z212、m/z262、m/z277，定量離子為m/z86。

以標(biāo)準(zhǔn)系列溶液進(jìn)樣，測(cè)定不同濃度標(biāo)準(zhǔn)系列溶液中鹽酸克倫特羅的峰面積。以各標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度和對(duì)應(yīng)的峰面積進(jìn)行線性回歸，則有：Y=18.23X+7.283，r2=0.995 396，相關(guān)系數(shù)大于0.995，說(shuō)明該方法適用于鹽酸克倫特羅的定量分析。將標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋至一定濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照3倍信噪比得儀器檢出限為5.0 μg/L，方法檢出限為0.5 μg/kg。

2.2精密度和回收率經(jīng)檢測(cè)，豬肝樣品中鹽酸克倫特羅為陰性（未檢出），稱取18份豬肝樣品作為空白樣品，選擇3組標(biāo)準(zhǔn)溶液（10、20、100 μg/L），分別向豬肝空白中加入0.50 mL，3個(gè)加標(biāo)水平各做了6個(gè)平行回收試驗(yàn)，計(jì)算精密度和回收率。

由表1可知，豬肝樣品中鹽酸克倫特羅各個(gè)濃度點(diǎn)的回收率在85%～95%，而相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）在1.6%～2.2%，符合現(xiàn)行獸藥殘留的分析要求。

2.3樣品測(cè)試結(jié)果對(duì)慈溪市超市和農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)所售豬肉和豬肝進(jìn)行抽樣檢查，共計(jì)32份，結(jié)果鹽酸克倫特羅均未檢出。

3結(jié)論與討論

3.1結(jié)論采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法對(duì)動(dòng)物組織中的鹽酸克倫特羅進(jìn)行前處理，測(cè)得回收試驗(yàn)的回收率在88%～94%，而相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）在1.6%～2.2%，方法檢出限為0.5 μg/kg，說(shuō)明該方法適用于鹽酸克倫特羅的定量分析。對(duì)32種豬肉和豬肝進(jìn)行抽樣檢查，結(jié)果鹽酸克倫特羅均未檢出。

3.2討論由于鹽酸克倫特羅已經(jīng)全面禁止在動(dòng)物生產(chǎn)中應(yīng)用，所以許多國(guó)家并沒有具體確定動(dòng)物性產(chǎn)品中最大殘留限量值（MRL）。荷蘭規(guī)定，牛、馬肝臟鹽酸克倫特羅的MRL值為0.5 μg/kg；英國(guó)規(guī)定，可食性組織中MRL值為0.5 μg/kg；我國(guó)暫未規(guī)定。美國(guó)食品藥品管理局（FDA）和世界衛(wèi)生組織（WHO）建議，動(dòng)物組織中的鹽酸克倫特羅的MRL值為：肉0.2 μg/kg、肝0.6 μg/kg、腎0.6 μg/kg、脂肪0.2 μg/kg和奶0.05 μg/kg[5]。目前我國(guó)使用的液相色譜法、氣質(zhì)聯(lián)用儀法的最低檢測(cè)限一般都在0.5 μg/kg以上；酶聯(lián)免疫法最低檢測(cè)限可達(dá)0.05 μg/kg，但假陽(yáng)性很高，例如有資料報(bào)道，用酶聯(lián)法檢測(cè)牛組織中得鹽酸克倫特羅可產(chǎn)生6.8%的假陽(yáng)性，另外有36.0%陽(yáng)性樣品不能被確認(rèn)[5]。檢測(cè)方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，無(wú)法同時(shí)滿足定性和定量2個(gè)方面的要求。所以，研究快捷、高效、操作簡(jiǎn)單、價(jià)格低廉，且檢測(cè)限更低的方法迫在眉睫，真正從定性和定量2個(gè)方面實(shí)現(xiàn)鹽酸克倫特羅殘留的有效檢測(cè)。

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