攜帶IBV DNA疫苗重組減毒沙門氏菌的構(gòu)建及免疫原性研究

李玉玲，王紅寧，曾瑜虹，陽 泰，郭自成

(四川大學生命科學學院動物疫病防控與食品安全四川省重點實驗室，四川成都610064)

禽傳染性支氣管炎(Infectious bronchitis，IB)是由IB病毒(IBV)引起雞的一種急性、高度接觸性的傳染病，是目前危害養(yǎng)禽業(yè)最嚴重的病毒性傳染病之一，給養(yǎng)禽業(yè)造成嚴重經(jīng)濟損失[1]。IB的控制主要依賴于疫苗的預(yù)防接種，滅活疫苗成本高，弱毒疫苗存在重組和毒力返強的危險。IBV主要通過呼吸道黏膜途徑感染機體，因此在局部建立有效的黏膜免疫應(yīng)答對于IB的控制有著重要的意義。減毒沙門氏菌X4550株是已注冊認可的可用于口服的商用疫苗菌株，該菌株不含抗生素抗性基因，可以通過口服、滴鼻途徑免疫，直接攜帶重組質(zhì)粒進入動物細胞內(nèi)表達相應(yīng)的蛋白[2]，對呼吸道黏膜免疫、體液免疫、細胞免疫和攻毒保護有增強作用?？诜緩浇臃N，適用于規(guī)?；B(yǎng)殖的群體免疫[3]。

本課題組前期研究結(jié)果表明，IBV3基因(S1基因、M基因、N基因)混合疫苗的免疫效果優(yōu)于單基因免疫的效果[4]。本研究聯(lián)合運用攜帶有IBV S1、M、N基因的pVAX1-S1，pVAX1-M，pVAX1-N重組質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)入減毒沙門氏菌X4550株，構(gòu)建IBV S1、M、N基因DNA質(zhì)粒重組減毒沙門氏菌X4550疫苗株(X4550/pVAX1-S1、X4550/pVAX1-M和X4550/pVAX1-N)，用間接免疫熒光法(IFA)檢測重組減毒沙門氏菌X4550疫苗株體外表達，經(jīng)口服免疫SPF雞，測定體內(nèi)組織分布及穩(wěn)定性、特異性IgG、IgA、CD4+和CD8+T細胞含量并進行攻毒實驗。以期為研制IBV基因減毒沙門氏菌疫苗提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 病毒株、質(zhì)粒、疫苗、細菌株和雞胚 IBV SAIBk株(DQ288927)、重組質(zhì)粒pVAX1-S1、pVAX1-M和pVAX1-N由四川大學生命科學學院動物疫病防控與食品安全四川省重點實驗室惠贈；IBV M41株、IBV陽性血清、陰性血清購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；雞IBV高免血清為本實驗室制備；IBV H120減毒苗購自瑞普(保定)生物藥業(yè)有限公司；減毒沙門氏菌X4550株由美國亞利桑那州立大學生物設(shè)計中心Roy Curtiss教授惠贈；SPF雞胚購自北京市實驗動物中心。

限制性內(nèi)切酶購自寶生物工程(大連)有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑購自Invitrogen公司；雞IgA ELISA檢測試劑盒購自美國Adlitteram Diagnostic Laboratories，Inc.；FITC 標 記 的 CD4+、PE標記的CD8+T細胞單克隆抗體(MAb)購自美國Southern Biotechnology；FITC標記兔抗雞IgG熒光抗體購自Sigma公司；HRP標記兔抗雞IgG酶標抗體購自武漢晶美生物工程有限公司。

1.2 IBV S1、M、N基因DNA質(zhì)粒重組減毒沙門氏菌X4550疫苗株構(gòu)建、鑒定及制備 按照《分子克隆實驗指南》具體操作程序，用CaCl2法制備沙門氏菌X4550感受態(tài)細胞。分別將重組質(zhì)粒pVAX1-S1、pVAX1-M、pVAX1-N及空質(zhì)粒pVAX1轉(zhuǎn)入減毒沙門氏菌X4550感受態(tài)，構(gòu)建IBV S1、M、N基因DNA質(zhì)粒重組減毒沙門氏菌X4550疫苗(X4550/pVAX1-S1、X4550/pVAX1-M、X4550/pVAX1-N)以及X4550/pVAX1。菌落PCR鑒定，酶切分析。

將含有 X4550/pVAX1-S1、X4550/pVAX1-M和X4550/pVAX1-N的LB液體培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)后，用滅菌的 PBS，調(diào)整細菌濃度至 109cfu/mL，即OD600nm=0.6～0.8，按 1∶1∶1體積比將這 3種菌液混勻，作為動物免疫實驗的3個基因混合疫苗。

1.3 pVAX1-S1、pVAX1-M和pVAX1-N真核質(zhì)粒在細胞中的表達檢測 3種重組真核質(zhì)粒經(jīng)純化后轉(zhuǎn)染COS-7細胞，采用IFA方法檢測目的蛋白在細胞中的表達情況，一抗為雞IBV高免血清，二抗為FITC標記兔抗雞IgG熒光抗體。

1.4 免疫雞及分組 將7日齡SPF雛雞隨機分成5組，每組30只雞。7日齡為首免，兩周后加強免疫一次，免疫前實驗雞禁水禁食4 h。

表1 免疫雞分組Table 1 Experimental design

1.5 重組菌X4550/pVAX1-GFP的構(gòu)建、組織分布及穩(wěn)定性測定 將構(gòu)建的重組菌X4550/pVAX1-GFP的濃度配制為109cfu，取15只7日齡SPF雛雞，每只雞喂食1 mL，分別于喂食后3 d、6 d、9 d各迫殺2只雞，取心、肝、脾、肺、腎、睪丸(卵巢)、小腸7個組織，制備成冰凍切片，在熒光顯微鏡下迅速觀察X4550/pVAX1-GFP在這7個組織的分布情況。

將 3種重組菌按 1∶1∶1(體積比)混勻，取 10只7日齡SPF雛雞，口服接種3種重組菌的混合疫苗，免疫后6周隨機迫殺4只雞，取肺組織和腎臟，用PBS液制備組織勻漿，涂板培養(yǎng)后，做S1、M、N基因菌落PCR擴增檢測。

1.6 特異性IgG測定 應(yīng)用不連續(xù)蔗糖密度梯度離心法純化IBV，包被ELISA酶標板。首免后2周及6周，每組隨機選取5只雞，翅靜脈采血，室溫靜置，分離血清，采用間接ELISA法檢測特異性IBV血清抗體，同時作陽性和陰性對照，二抗為HRP標記兔抗雞IgG酶標抗體。

1.7 腸道黏膜IgA測定 首免后6周，每組隨機迫殺5只雞，按文獻[5]方法采集并制備小腸粘膜樣品，固相夾心ELISA測定腸道黏膜IgA濃度。具體步驟參照雞免疫球蛋白A(IgA)ELISA檢測試劑盒說明書。

1.8 淋巴細胞CD4+和CD8+T檢測 首免后2周及6周，每組隨機選取5只雞，翅靜脈采集全血，密度梯度離心法分離外周血淋巴細胞，F(xiàn)ITC標記CD4+T細胞，PE標記CD8+T細胞，流式細胞儀檢測CD4+和CD8+T細胞亞類含量，每個樣品計數(shù)3萬個細胞。

1.9 攻毒保護試驗 首免后6周IBV M41104EID50，0.2 mL/羽，滴鼻和點眼(各一半)攻毒，每組15只雞。觀察雞只有無不良反應(yīng)和死亡情況，當日迫殺有癥狀及死亡雞只，無菌采集有癥狀雞只氣管及肺組織制備勻漿，從氣管、肺組織勻漿上清液中提取RNA，做S1、M、N基因RT-PCR，記錄病毒的分離情況；觀察死亡雞只組織病變，確定死因。攻毒后第5 d及第10 d每組迫殺5只雞，第15 d迫殺全部存活無癥狀雞只，分離病毒，方法同上。死亡雞和迫殺雞病毒檢出陽性的為未保護，迫殺和存活雞只病毒檢出陰性者判定為受保護。

1.10 統(tǒng)計學分析 采用PRISM軟件對所得數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，統(tǒng)計學差異設(shè)為p<0.05。

2 結(jié)果

2.1 IBV S1、M、N基因重組沙門氏菌疫苗構(gòu)建鑒定結(jié)果 如圖1顯示，可擴增出和預(yù)期目的基因大小相符的片段以及質(zhì)粒pVAX1片段，表明IBV S1、M、N基因已被正確插入到真核表達載體pVAX1，并成功轉(zhuǎn)入減毒沙門氏菌X4550中。

2.2 pVAX1-S1、pVAX1-M、pVAX1-N真核質(zhì)粒的體外表達檢測結(jié)果 在藍光激發(fā)下，轉(zhuǎn)染了pVAX1-S1、pVAX1-M、pVAX1-N真核質(zhì)粒的COS-7細胞，顯示出特異性黃綠色熒光，而轉(zhuǎn)染了pVAX1的細胞沒有顯示出任何特異熒光，表明IBV SAIBk株S1、M、N蛋白在COS-7細胞中均獲得表達(圖 2)。

2.3 重組菌X4550/pVAX1-GFP的組織分布及穩(wěn)定性測定結(jié)果 實驗雞腸、脾、肝、心、腎、肺6個組織，在熒光顯微鏡下均能觀察到綠色熒光蛋白GFP的表達，生殖器官睪丸(卵巢)未觀察到GFP的表達(圖 3)。

重組菌接種后6周，從肺和腎臟進行細菌分離，并進行S1、M、N基因的菌落PCR擴增，結(jié)果表明分離菌中均能擴增出與3個基因大小相符的DNA片段。

2.4 抗IBV特異性IgG檢測結(jié)果 首免后2周，X4550/pVAX1-S1/M/N組即可刺激實驗雞產(chǎn)生IBV特異性IgG抗體，OD值高于PBS組(p<0.01)和 X4550/pVAX1組(p<0.05)， 但 低 于 H120組(p<0.05)。二免后4周，X4550/pVAX1-S1/M/N組和H120組OD值繼續(xù)升高，pVAX1-S1/M/N組OD值呈下降趨勢且和PBS組比較已無統(tǒng)計學差異(p>0.05)(圖4)。

2.5 腸道黏膜IgA檢測結(jié)果 首免后6周，經(jīng)黏膜途徑接種的X4550/pVAX1-S1/M/N組(口服)和H120組(滴鼻)，均能誘發(fā)極高的黏膜IgA濃度，顯著高于 PBS組和 X4550/pVAX1組(p<0.01)；pVAX1-S1/M/N組不能刺激局部IgA濃度的升高(圖5)。

2.6 淋巴細胞CD4+、CD8+T檢測結(jié)果 X4550/pVAX1-S1/M/N組的CD4+T淋巴細胞含量，僅需免疫一次，其水平就明顯上升，首免后2周，顯著高于PBS組(p<0.01)，加強免疫后，含量繼續(xù)升高，二免后4周顯著高于PBS組、pVAX1-S1/M/N組及X4550/pVAX1組(p<0.01)。H120組動態(tài)變化趨勢與X4550/pVAX1-S1/M/N組完全相同。接種X4550/pVAX1-S1/M/N組疫苗可以刺激CD8+T細胞含量逐漸升高，二免后4周顯著高于PBS組、pVAX1-S1/M/N組及X4550/pVAX1組(p<0.01)。H120組CD8+T淋巴細胞含量始終穩(wěn)定在較高水平，和PBS組比較差異顯著(p<0.01)，但與X4550/pVAX1-S1/M/N組無統(tǒng)計學差異(p>0.05)(圖6)。

2.7 攻毒保護實驗結(jié)果 將各次檢測結(jié)果相加，H120組攻毒保護(12/15只雞)，X4550/pVAX1-S1/M/N組攻毒保護(11/15只雞)和pVAX1-S1/M/N組攻毒保護(10/15只雞)，3組間無統(tǒng)計學差異(p>0.05)，顯著高于 PBS組和 X4550/pVAX1組(p<0.01)(表2)。表明X4550/pVAX1-S1/M/N疫苗具有免疫保護作用。

表2 IBV M41株攻毒后，各組保護效果比較Table 2 Protection rate of different groups challenged by IBV M41 strain

3 討論

本實驗結(jié)果表明，重組減毒沙門氏菌X4550疫苗株可致腸道黏膜IgA顯著升高。減毒沙門氏菌可將重組質(zhì)粒直接運送給APC并在其內(nèi)表達，可刺激強烈的原位黏膜免疫反應(yīng)，產(chǎn)生局部IgA，通過共同的黏膜免疫系統(tǒng),還可致遠處的黏膜表面(如呼吸道、口腔、生道、淚腺)誘發(fā)較強的黏膜免疫，形成抵抗病原侵入的第一道屏障[8]。IgG是血液循環(huán)中具有中和作用的主要抗體，可阻止病毒吸附于易感靶細胞，而降低病毒的傳染性，減輕臨床癥狀[9]，本研究構(gòu)建的重組菌疫苗，接種后可致IgG滴度顯著高于PBS組及空載體組。重組減毒沙門氏菌X4550疫苗株還可致CD4+、CD8+T細胞含量顯著升高，MHCⅠ限制的CD8+CTL可有效清除病毒粒子[10]；MHCⅡ限制的CD4+Th1反應(yīng)可以促使CD8+CTL的增殖、成熟和功能活化，有助于B細胞活性增加，并能直接誘導抗病毒的淋巴活素的產(chǎn)生[11]。細胞免疫不但可以對IBV最初的感染具有抑制作用，而且在IBV的攻毒保護中，起著重要的作用[9]。

IBV S1、M、N基因DNA質(zhì)粒重組減毒沙門氏菌X4550疫苗，可經(jīng)循環(huán)系統(tǒng)到達效應(yīng)器官并穩(wěn)定存在于其中；口服免疫SPF雞，腸道黏膜IgA濃度、CD4+和CD8+T淋巴細胞顯著增多，并產(chǎn)生良好的免疫保護效果；口服還方便了疫苗的接種。減毒沙門氏菌遞送DNA疫苗進入機體，是否具有免疫原性，關(guān)鍵在于能否到達效應(yīng)器官，并在效應(yīng)器官穩(wěn)定存在足夠長的時間[6]。本研究減毒沙門氏菌X4550組織定位實驗結(jié)果表明，除睪丸(卵巢)外，小腸、心臟、肝臟、脾臟、肺組織和腎臟6個器官均能觀察到GFP的表達，提示X4550能將重組質(zhì)粒帶至遠處實質(zhì)性器官并釋放重組質(zhì)粒，目的基因開始轉(zhuǎn)錄并得到表達。本研究為研制IBV基因減毒沙門氏菌疫苗提供了實驗依據(jù)。

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