96孔板－PCR排除法篩選豬蛔蟲雌蟲卵黃蛋白原基因

魏冬霞，鄧 艷，吳紹強，林瑞慶，宋慧群，朱興全

(1.江蘇畜牧獸醫(yī)職業(yè)技術學院動物醫(yī)學院，江蘇泰州225300；2.華南農業(yè)大學獸醫(yī)學院，廣東廣州510642；3.廣州機場出入境檢驗檢疫局綜合實驗室，廣東廣州510470；4.中國檢驗檢疫科學研究院，北京100029)

豬蛔蟲病是由蛔科(Ascaridae)的豬蛔蟲(Ascaris suum)寄生于豬小腸引起的一種線蟲病。該病不僅給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴重經(jīng)濟損失，而且由于豬蛔蟲感染性幼蟲還會引起人的眼幼蟲移行癥和內臟幼蟲移行癥，對人類健康構成危害[1-2]。由于豬蛔蟲產卵量大，蟲卵對外界環(huán)境抵抗力強等因素，從而造成豬蛔蟲病的廣泛流行。卵黃蛋白原(VIT)為雌性腸道上皮細胞合成的一種具有脂類結合能力的蛋白質，它可以通過受體介導的細胞內吞作用進入卵巢中的胚胎內，為后代的發(fā)育提供能量。如能選擇性地抑制或阻斷豬蛔蟲雌蟲VIT基因的表達，則可抑制成蟲的繁殖及產卵，從而有效地控制豬蛔蟲病的傳播和流行。本研究以豬蛔蟲雌蟲VIT基因的EST序列為模板設計引物，對豬蛔蟲雌蟲cDNA文庫進行篩選，并獲得了豬蛔蟲VIT基因序列，為該基因的深入研究奠定基礎。

目前用于文庫篩選的方法很多，傳統(tǒng)的文庫篩選方法包括原位雜交篩選、抗體篩選和功能表達篩選。這些方法的缺點是消耗材料多，并且費時費力。而以PCR為基礎的篩選文庫方法具有許多優(yōu)勢[3-5]。本研究利用PCR法和排除法相結合的96孔板-PCR排除法對豬蛔蟲雌蟲的cDNA文庫進行篩選，獲得了豬蛔蟲雌蟲VIT基因序列。

1 材料和方法

1.1 cDNA擴增文庫和陽性對照菌 豬蛔蟲雌蟲cDNA文庫由華南農業(yè)大學寄生蟲學研究室構建[6]，文庫擴增后滴度達3×109cfu/mL，插入片段在0.7 kb～2 kb之間，平均插入片段長度1.2 kb，每孔原始克隆數(shù)約為1800個；陽性對照重組菌F993(試驗編號)系經(jīng)抑制消減雜交方法篩選出的豬蛔蟲雌蟲差異表達的cDNA插入pGEM-T載體(Promega)中，轉化E.coliJM109感受態(tài)細胞[7]，該重組菌株由本實驗室制備并保存。

1.2 主要試劑和引物 DL-2000 DNA Marker和TaqDNA聚合酶購自寶生物工程(大連)有限公司。

根據(jù)重組菌株F993的EST序列設計引物，其序列為：F993UP：5'-ACGACGAGGAGTGCGAC AT-3'； F993DOWN： 5'-GTAGAGCGAGGCAGACA AG-3'，擴增產物為274 bp。由北京賽百盛基因技術有限公司合成。

1.3 PCR反應條件 PCR擴增條件：94℃5 min；94℃30 s、55℃30 s、72℃30 s，35個循環(huán)；72℃5 min。

1.4 cDNA文庫的初步篩選 分別取1 μL保存于96孔細胞培養(yǎng)板上的擴增文庫在96孔PCR反應板中進行PCR擴增，同時設陽性對照(克隆F993的菌液)和空白對照，擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳。

1.5 cDNA文庫分部排除篩選

1.5.1 分板排除非陽性克隆 取含有陽性克隆的擴增文庫10 μL，用LB液體培養(yǎng)基進行10倍倍比稀釋，分別取1 μL稀釋液進行PCR檢測，確定可檢測到陽性條帶的最大稀釋倍數(shù)。然后取1 μL含陽性克隆的最大稀釋倍數(shù)的稀釋液(即可檢測到陽性信號的最大稀釋倍數(shù)的下級稀釋液50 μL)鋪含有氯霉素的LB培養(yǎng)板，37℃過夜培養(yǎng)。平板上的菌落分別用LB液體培養(yǎng)液洗脫菌落，并對收集的菌液進行PCR檢測，確定含陽性克隆的洗液。

1.5.2 分區(qū)排除非陽性克隆 將含陽性克隆的洗液按上述方法進行稀釋，PCR檢測和鋪板培養(yǎng)。收菌時每板分4～6區(qū)收取單菌落。如此經(jīng)幾輪篩選，直到能確保在100個以下的克隆里含有1個陽性克隆為止。

1.6 陽性克隆的鑒定 直接挑取經(jīng)篩選后的克隆進行PCR鑒定；或者將每板上的菌落按每10個～20個克隆分區(qū)，每區(qū)的克隆挑在同1個培養(yǎng)管中，37℃，170 r/min過夜培養(yǎng)，然后進行菌液PCR確定含陽性克隆的區(qū)，最后再挑取原板中陽性區(qū)的單克隆到800 μL LB液體培養(yǎng)基中，加入氯霉素后37℃過夜培養(yǎng)。分別取1 μL單克隆菌液做模板進行PCR，鑒定出陽性克隆。最后鑒定陽性克隆插入片段的大小。將檢測到的克隆菌液進行擴繁與鑒定后測序，并對該序列進行初步分析。

2 結果與討論

2.1 cDNA文庫的初步篩選結果 初步篩選擴增文庫(保持于96孔板上)，結果見圖1。選取陽性信號較強的孔G10做下一步篩選。結果顯示，幾乎所有的孔均為陽性，表明該基因是高豐度基因，這與吳紹強等從豬蛔蟲雌蟲和雄蟲的抑制消減文庫中挑出的隨機克隆測序結果相符[7]，表明該基因在豬蛔蟲雌蟲中呈高表達狀態(tài)。

2.2 分部排除篩選cDNA文庫

2.2.1 含陽性克隆最大稀釋倍數(shù)的確定 從G10孔中取10 μL原擴增文庫分別做10倍系列稀釋后進行PCR檢測，結果顯示檢測到陽性信號的最大稀釋倍數(shù)為 104(圖 2)。

2.2.2 含陽性克隆板的確定 將收集的菌液做PCR，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測確定含強陽性克隆的培養(yǎng)板為板3和板5(圖 3)。

2.3 陽性克隆的鑒定 取上述105倍的稀釋液再進行涂板、培養(yǎng)、收菌、PCR鑒定，經(jīng)幾輪篩選后，最后得到64個菌落，經(jīng)鑒定菌落A10為強陽性，編號為 F993-G10-A10(圖 4)。

2.4 基因序列分析 陽性克隆F993-G10-A10測序結果顯示，其序列長621 bp，有完整的3'端。在線BLAST分析表明該序列與秀麗新桿線蟲的VIT基因家族成員(Vit1、Vit2、Vit3、Vit4和Vit5)有一定同源性。其推導的氨基酸序列與秀麗隱桿線蟲的VIT基因家族成員的氨基酸序列一致性分別為35%、35%、34%、34%和35%，相似性分別為55%、57%、54%、54%和53%。在EST數(shù)據(jù)庫中經(jīng)BLASTn分析，在與其相匹配的序列中，E值小于2e-31的有47條，這些EST序列均來源于豬蛔蟲，它們的功能也相似于秀麗隱桿線蟲的VIT。該基因已錄入 GenBank(AM262190)。

本研究根據(jù)從豬蛔蟲雌蟲抑制消減文庫中選取的特異性EST序列設計引物，運用96孔板-PCR排除法對豬蛔蟲雌蟲cDNA文庫進行篩選，獲得了豬蛔蟲雌蟲VIT基因。該陽性克隆的獲得為該基因的進一步研究奠定了基礎。同時，也證明了96孔-PCR排除法是一種特異、高效、簡便、成本低的篩選文庫方法。

[1]汪世平.醫(yī)學寄生蟲學[M].北京：高等教育出版社，2004.

[2]Inatomi Y,Murakami T,Tokunaga M,et al.Encephalopathy caused by visceral larva migrans due toAscaris suum[J].J Neu Sci,1999,164(2):195-199.

[3]徐碧玉，蘇偉，張建斌，等.香蕉果實SMART cDNA文庫的構建及利用PCR方法篩選香蕉Actin2基因[J].熱帶亞熱帶植物學報，2005，13(5)：375-380.

[4]Israel D I.A PCR-based method for high stringency screening of DNA libraries[J].Nucleic Acid Res,1993,21:2627-2631.

[5]Munroe D J,Loebbert R,Bric E,et al.Systematic screening of an arrayed cDNA library by PCR[J].Proc Natl Acad Sci USA,1995,92:2209-2213.

[6]魏冬霞，鄧艷，吳紹強，等.用SMART技術構建豬蛔蟲雌蟲 cDNA文庫[J].中國預防獸醫(yī)學報，2007，29(3)：180-184.

[7]吳紹強，鄒豐才，翁亞彪，等.利用抑制消減雜交技術篩選豬蛔蟲性別差異表達基因[J].中國農業(yè)科學，2005，38(6)：1040-1045.