志賀氏菌屬環(huán)介導(dǎo)恒溫擴增快速檢測方法的建立及初步應(yīng)用

徐義剛，崔麗春，張昕哲，李蘇龍，于恒純，張子群，李丹丹

(1.黑龍江出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心，黑龍江哈爾濱150001；2.東北林業(yè)大學(xué)，黑龍江哈爾濱150040；3.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，黑龍江哈爾濱150030；4.海南出入境檢驗檢疫局，海南?？?70125)

志賀氏菌(Shigella)俗稱痢疾桿菌，是一類引起人急性感染性痢疾的最常見病原菌。人主要通過食用被志賀氏菌污染的食品而感染發(fā)病，以全身中毒癥狀和大腸化膿性炎癥為主要臨床特征，具有公共衛(wèi)生學(xué)意義[1]。建立志賀氏菌快速、準確、靈敏、特異的檢測方法，不僅為及時有效控制食源性傳染病提供依據(jù)，同時也是保障人類健康的必要手段。

目前，我國志賀氏菌屬的檢測方法主要采用國標法(GB/T4789.5-2003)，該方法主要為細菌分離和培養(yǎng)鑒定，操作繁瑣，檢測周期長，并且靈敏度低。其他檢測方法，如ELISA、PCR、實時熒光PCR(real-time PCR)等，則存在檢測靈敏度低(ELISA法)和檢測儀器昂貴(real-time PCR儀)等問題[2-5]。Notomi等研發(fā)的環(huán)介導(dǎo)恒溫擴增技術(shù)(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)，針對靶基因的6個區(qū)域設(shè)計4條特異引物，利用鏈置換DNA聚合酶在恒溫條件作用40 min～60 min，即可完成核酸擴增反應(yīng)，直接通過擴增副產(chǎn)物焦磷酸鎂沉淀的濁度判斷是否發(fā)生反應(yīng)[6]。LAMP方法具有操作簡便、檢測快速、靈敏度高并且成本低廉等優(yōu)點，在疾病診斷、病原檢測等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[7]。本研究利用該項技術(shù)建立了志賀氏菌LAMP快速檢測方法。

1 材料和方法

1.1 細菌株和主要試劑 實驗菌株購自美國典型菌種保藏中心(ATCC)和中國醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏管理中心(CMCC)；分離株由本實驗室分離并保存(表2)；TaqDNA Polymerase和甜菜堿購自Sigma公司；BstDNA Polymerase購自NEB公司；細菌基因組DNA提取試劑盒購自TaKaRa公司；復(fù)合增菌培養(yǎng)基、3%NaCl蛋白胨水和緩沖蛋白胨液(Buffered Peptone Water，BPW)均購自北京蘭伯瑞生物技術(shù)公司。

1.2 引物設(shè)計 根據(jù)志賀氏菌屬ipaH基因序列(M76445)，設(shè)計外引物 F3/B3及內(nèi)引物 FIP/BIP、PCR引物和實時熒光PCR引物(表1)，引物及探針由TaKaRa公司合成。

1.3 基因組DNA的提取 將表2中細菌分別接種于復(fù)合增菌培養(yǎng)基(弧菌用3%NaCl蛋白胨水培養(yǎng)，其他菌株用BPW培養(yǎng))中，按各細菌最適生長溫度培養(yǎng)，分別采用煮沸法(LAMP特異性試驗)和試劑盒法(LAMP靈敏度試驗)提取基因組DNA。

1.4 LAMP反應(yīng)條件 50 μL反應(yīng)體系：10×ThermoPol Buffer 5 μL、 2.5 mmol/L dNTP 8 μL、100 mmol/L MgSO44 μL、 FIP/BIP(40 mmol/L)和F3/B3(20 mmol/L)各 1 μL、10 mmol/L 甜菜堿 4 μL、5 u/μLTaqDNA Polymerase 和 8 u/μLBstDNA Polymerase 2 μL、DNA 模板 1 μL。65 ℃水浴作用40 min～60 min，目測反應(yīng)管中液體渾濁度變化，判斷是否發(fā)生反應(yīng)，同時進行瓊脂糖凝膠電泳驗證。

表1 LAMP、PCR和real-time PCR引物及探針序列Table 1 Primers and probe sequence for LAMP,PCR and real-time PCR

1.5 LAMP靈敏度試驗 將濃度約為2.8×107cfu/mL的志賀氏菌進行10倍倍比稀釋，提取DNA進行LAMP擴增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增效果，確定試驗靈敏度。同時進行PCR及real-time PCR檢測志賀氏菌靈敏度試驗，PCR反應(yīng)條件：95℃4 min；95℃ 30 s、58.5℃ 30 s、72℃ 40 s，30個循環(huán)；72℃5 min。Real-time PCR反應(yīng)條件：37℃5 min；95℃ 3 min、94℃ 10 s、60℃ 40 s，40個循環(huán)。比較3種方法的檢測靈敏度。

1.6 LAMP特異性試驗 利用建立的LAMP方法檢測表2中細菌基因組DNA，驗證本方法的特異性。

1.7 污染食品LAMP方法檢測靈敏度試驗 取10 g無志賀氏菌的豬肉樣品，加入90 mL堿性蛋白胨水，制成勻漿，加入1 mL菌體濃度約為3.5×107cfu/mL的志賀氏菌，取勻漿進行10倍倍比稀釋，提取基因組DNA，進行LAMP擴增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增結(jié)果，以確定檢測靈敏度。

1.8 臨床樣品檢測及符合率試驗 將志賀氏菌LAMP方法應(yīng)用于檢疫實踐中，并與國標法進行比較，驗證兩者的符合率。

2 結(jié)果

2.1 志賀氏菌LAMP方法的建立 目測觀察陽性反應(yīng)管內(nèi)部溶液變渾濁，表明產(chǎn)生了LAMP擴增副產(chǎn)物焦磷酸鎂，即發(fā)生LAMP反應(yīng)(圖1：B-2)，而對照管溶液未變渾濁(圖1：B-1)。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳驗證，陽性反應(yīng)管呈現(xiàn)典型的LAMP擴增電泳條帶(圖1：A-4、A-5)。采用熒光顯色法檢測，陽性反應(yīng)管呈現(xiàn)典型的綠色熒光(圖1：C-2)。

2.2 LAMP靈敏度試驗 將已知濃度的志賀氏菌進行10倍倍比稀釋，提取基因組DNA進行LAMP擴增，經(jīng)凝膠電泳檢測驗證，該LAMP方法對純培養(yǎng)菌的檢測靈敏度為28 cfu/mL(圖2)。

2.3 特異性試驗 利用建立的LAMP方法對表2中32種共50株細菌進行檢測，結(jié)果如表2所示，其中7株志賀氏菌為陽性，而其他菌為陰性，表明該方法具有高度特異性。

2.4 LAMP、普通PCR及real-time PCR法檢測靈敏度比較 普通PCR和real-time PCR法檢測志賀氏菌靈敏度如圖3和圖4所示。PCR法檢測靈敏度為280 cfu/mL，real-time PCR方法檢測靈敏度為28 cfu/mL。LAMP方法的檢測靈敏度比普通PCR法高10倍，與real-time PCR方法的靈敏度基本相同。

2.5 污染食品志賀氏菌靈敏度檢測結(jié)果 將含有志賀氏菌濃度3.5×105cfu/g的豬肉勻漿液進行10倍倍比稀釋，以每個稀釋度作為污染食品模型樣本進行LAMP檢測，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果顯示該LAMP方法對污染食品中志賀氏菌的檢測靈敏度為 35 cfu/mL(圖 5)。

表2 志賀氏菌LAMP方法特異性試驗菌株及檢測結(jié)果Table 2 Bacteria strains and detection results for specificity of LAMP assay ofShigella

2.6 臨床樣品檢測及符合率試驗 2009年4月至2009年11月期間，利用LAMP方法對195份涉及肉類、奶類、豆制品及人工污染樣品進行檢測，共檢出29份陽性，與國標法檢測結(jié)果符合率為100%(表3)，表明該LAMP方法具有良好的可靠性。

表3 LAMP方法與國標法對比結(jié)果Table 3 Comparison between LAMP method and bacteria isolation and identification

3 討論

本研究利用環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)建立的志賀氏菌屬LAMP檢測方法，操作方便，40 min～60 min內(nèi)即可完成致病菌檢測，可以滿足食源性致病菌快速檢測的要求，實驗裝置簡單，結(jié)果判斷直觀，具有廣泛應(yīng)用價值。

利用該LAMP方法對包括志賀氏菌在內(nèi)的32種共50株細菌進行檢測，結(jié)果顯示其中7株志賀氏菌為LAMP陽性，而其他細菌為陰性，表明該LAMP方法具有高度特異性。為確定該方法的檢測靈敏度，對已知濃度的致病菌進行10倍倍比稀釋，提取每個稀釋度細菌基因組DNA作為模板進行LAMP擴增，瓊脂糖凝膠電泳檢測顯示，該LAMP方法對純培養(yǎng)的志賀氏菌檢測靈敏度可達28 cfu/mL，對污染食品中志賀氏菌的檢測靈敏度為35 cfu/mL，能夠滿足食源性致病菌檢測限量要求。此外，本研究比較了該LAMP方法與普通PCR法及real-time PCR法檢測志賀氏菌的靈敏度，結(jié)果顯示該方法檢測靈敏度較PCR法高10倍，而與real-time PCR方法檢測靈敏度基本相同。檢驗檢疫實踐證實，該LAMP方法與國標法檢測結(jié)果的符合率為100%，表明了該方法的可靠性。從實驗易操作性、結(jié)果判定直觀、低成本的角度出發(fā)，該LAMP方法具有較好的應(yīng)用前景。

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