殼聚糖對(duì)黃瓜苗期猝倒病的防控效果

諶江華，陳若霞，李 斌

(1.浙江省寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江 寧波 315040;2.浙江大學(xué)生物技術(shù)研究所，浙江 杭州 310029)

黃瓜苗期猝倒病是黃瓜育苗中的常見(jiàn)病害，一般苗床發(fā)病率為20%～50%，嚴(yán)重時(shí)可達(dá)80%以上［1］。特別是在設(shè)施栽培條件下，黃瓜苗期猝倒病發(fā)生更加普遍，危害日趨嚴(yán)重，已成為影響黃瓜育苗的首要問(wèn)題。黃瓜苗期猝倒病主要由腐霉菌(Pythium spp.)引起，生產(chǎn)上主要采用甲霜靈拌種或土壤處理來(lái)防治?；瘜W(xué)農(nóng)藥雖能在一定程度上防控該病，但同時(shí)也帶來(lái)了農(nóng)藥殘留超標(biāo)、環(huán)境污染和病害抗藥性等一系列問(wèn)題［2］。殼聚糖(chitosan)是甲殼素 (chitin)脫乙?；笮纬傻囊环N高分子陽(yáng)離子多聚糖，廣泛存在于真菌的細(xì)胞壁及蝦、蟹等甲殼動(dòng)物外殼中。殼聚糖能誘導(dǎo)植物產(chǎn)生多種抗病性反應(yīng)［3－5］，對(duì)多種植物病原微生物有明顯的抑制作用［6－8］。此外，殼聚糖具有無(wú)毒、施用后可被土壤微生物完全降解，不會(huì)對(duì)土壤微環(huán)境造成不利影響等優(yōu)點(diǎn)，這使其有可能作為一種新型的綠色農(nóng)藥在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中發(fā)揮重要的作用［9］。近年來(lái)，關(guān)于殼聚糖誘導(dǎo)植物抗病反應(yīng)和對(duì)一些植物病原菌抑制作用的研究已有不少報(bào)道，但有關(guān)殼聚糖不同產(chǎn)品不同濃度對(duì)蔬菜苗期猝倒病的防控效果則未見(jiàn)系統(tǒng)報(bào)道。本研究以黃瓜種子為試驗(yàn)材料，通過(guò)殼聚糖不同產(chǎn)品、不同濃度的離體抑菌活性和活體條件下不同產(chǎn)品、不同施用量對(duì)黃瓜猝倒病的防控效果的研究，為黃瓜的無(wú)公害栽培，特別是壯苗培育提供一定的技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試殼聚糖:殼Ⅰ (國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn))，殼Ⅱ (上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司生產(chǎn))，殼Ⅲ (浙江仙居縣滕旺殼聚糖廠生產(chǎn))，3種殼聚糖均為白色粉末，脫乙酰度大于95%。

供試病原菌為黃瓜猝倒病菌瓜果腐霉(Pythium.aphanidermatum)，F(xiàn)C42菌株，由浙江大學(xué)生物技術(shù)研究所提供。

供試黃瓜種子品種為津綠4號(hào) (引自天津黃瓜研究所)。洗去黃瓜種子表面的種衣劑，并用75%酒精消毒1 min后，放入溫水中浸種3 h，然后用紗布包裹放到30℃培養(yǎng)箱中催芽24 h后用于播種。

1.2 方法

1.2.1 殼聚糖母液的配制

準(zhǔn)確稱取一定量殼聚糖溶于2%冰醋酸溶液，pH調(diào)至6.5，配制成5 mg·mL－1的殼聚糖母液，121℃高壓蒸氣滅菌30 min后備用。

1.2.2 殼聚糖離體抑菌效果的測(cè)定

殼聚糖離體抑菌效果測(cè)定采用平板含毒介質(zhì)法。將預(yù)先做好的PDA培養(yǎng)基熔化，當(dāng)培養(yǎng)基冷卻至50℃左右時(shí)，分別加入適量的殼聚糖母液，制 成 0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2 和 1.5 mg·mL－17個(gè)不同濃度的含殼聚糖 PDA培養(yǎng)基，迅速搖勻后倒入9 cm直徑的培養(yǎng)皿中，制成含毒PDA平板。在平板中央接上1塊0.5 cm直徑的1日齡PDA腐霉菌餅。試驗(yàn)設(shè)不加殼聚糖溶液為空白對(duì)照 (CK)，每處理平板重復(fù)3次。接完菌后，放入25℃培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)，24和36 h后，十字交叉法測(cè)量菌落直徑2次，求平均值。根據(jù)下式計(jì)算出抑制率。

抑制率 (%) =［(CK的菌落直徑－處理菌落直徑)/(CK菌落直徑－5)］×100。

1.2.3 殼聚糖防控黃瓜苗期猝倒病效果的活體測(cè)定

殼聚糖防控黃瓜苗期猝倒病效果的活體測(cè)定采用毒土法。以高溫滅菌土壤為基質(zhì)，拌入殼聚糖，拌好后裝于育苗盤(pán)內(nèi)，然后將催好芽的黃瓜種子播于育苗盤(pán)的土上，種子旁邊接種1塊0.5 cm直徑的1日齡PDA腐霉菌餅，菌面朝下，蓋土，盤(pán)內(nèi)加適量去離子水以保持土壤濕潤(rùn)。試驗(yàn)設(shè)殼Ⅰ不同施用量處理和不同殼聚糖產(chǎn)品0.5 g·kg－1處理2組試驗(yàn)。第1組試驗(yàn)設(shè)不接菌 (CK)、腐霉、腐霉+ 殼Ⅰ 0.25 g·kg－1、腐霉 + 殼Ⅰ 0.5 g·kg－1和腐霉 +殼Ⅰ 1.0 g·kg－15個(gè)處理;第2組試驗(yàn)設(shè)不接菌 (CK)、腐霉、腐霉+殼Ⅰ、腐霉+殼Ⅱ和腐霉+殼Ⅲ 5個(gè)處理。重復(fù)3次，每重復(fù)24穴，每穴1顆黃瓜種子。

將處理好的育苗盤(pán)放入人工氣候箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為白天16 h和21℃，黑暗8 h和19℃，相對(duì)濕度85%，光照強(qiáng)度為10只BMC T5-25 W燈管，7 000 lx左右。各處理出苗后調(diào)查出苗率、發(fā)病率。收集健康植株，洗凈泥土后放入80℃烘箱中烘干24 h，最后分別稱量根、莖干重，計(jì)算單株根、莖干重。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用唐啟義等［10］的 DPS軟件采用鄧肯氏新復(fù)極差法 (DMRT)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 殼聚糖對(duì)腐霉菌的離體抑菌效果

離體抑菌試驗(yàn)結(jié)果表明，殼聚糖對(duì)腐霉菌具有直接的抑制作用。殼聚糖對(duì)腐霉菌的抑制率與殼聚糖的濃度呈正相關(guān)，濃度越大抑制率越高。不同殼聚糖產(chǎn)品對(duì)腐霉菌的抑制效果不同。3種殼聚糖中殼Ⅱ的抑制效果最好，0.8 mg·mL－1濃度24 h的抑制率即達(dá)100%，殼Ⅰ和殼Ⅲ的抑制效果較差，1.5 mg·mL－1濃度的抑制率才達(dá) 100% (表 1)。另外，比較培養(yǎng)24和36 h的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，殼聚糖對(duì)腐霉的抑制效果隨培養(yǎng)時(shí)間而變化，培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，抑制率降低。綜合以上結(jié)果可以看出，殼聚糖抑制腐霉菌菌絲生長(zhǎng)受到殼聚糖產(chǎn)品自身品質(zhì)、殼聚糖溶液濃度和培養(yǎng)時(shí)間的影響。

表1 殼聚糖離體抑菌的效果

2.2 殼聚糖對(duì)黃瓜猝倒病的活體防控效果

殼Ⅰ活體控病試驗(yàn)結(jié)果表明，土壤中施用殼聚糖對(duì)黃瓜猝倒病有較好防控效果。殼聚糖不同施用量對(duì)黃瓜猝倒病的防控效果不同 (表2)。施用0.5 g·kg－1殼聚糖對(duì)黃瓜猝倒病能起到較好的防控效果，處理后3 d的出苗率為65.28%，顯著高于腐霉處理的6.94%，處理后7 d猝倒病發(fā)病率顯著下降，為35.97%。殼聚糖施用量提高到1.0 g·kg－1時(shí)，防控效果則更加顯著提高，3 d后出苗率達(dá)76.39%，7 d后防治效果達(dá)80.21%。根、莖干重結(jié)果分析表明，殼聚糖施用后，植株生長(zhǎng)增強(qiáng)，根、莖干重顯著高于腐霉處理。

表2 殼聚糖不同施用量對(duì)黃瓜猝倒病的防控效果

試驗(yàn)結(jié)果還表明，不同殼聚糖產(chǎn)品對(duì)黃瓜猝倒病的防控效果差異明顯，且不同時(shí)段防控效果不同。3種殼聚糖中殼Ⅱ在出苗前對(duì)猝倒病的防控效果較好，出苗率為72.22%，顯著高于殼Ⅰ和殼Ⅲ，但出苗后殼Ⅱ的防控效果則不如殼Ⅰ和殼Ⅲ，出苗后7 d的防效為45.86%，明顯低于殼Ⅰ和殼Ⅲ的58.13%和56.41%，根、莖干重也低于殼Ⅰ和殼Ⅲ (表3)。綜合以上試驗(yàn)結(jié)果可以得出，殼聚糖對(duì)蔬菜猝倒病的活體防控效果除受到殼聚糖的施用量影響外，自身的品質(zhì)也很重要。

表3 不同殼聚糖對(duì)黃瓜猝倒病的防控效果

3 小結(jié)與討論

離體抑菌試驗(yàn)結(jié)果表明，殼聚糖直接抑制黃瓜苗期猝倒病菌的生長(zhǎng)，但抑制效果因殼聚糖產(chǎn)品理化性質(zhì)、使用濃度及培養(yǎng)時(shí)間的不同而異。供試3種殼聚糖中殼Ⅱ?qū)Ω咕囊种菩Ч糜跉あ窈蜌あ螅瑲あ虿捎?.8 mg·mL－1試驗(yàn)濃度，在 PDA上培養(yǎng)24 h的抑制率可達(dá)100%，顯著高于殼Ⅰ和殼Ⅲ相同試驗(yàn)濃度PDA上培養(yǎng)24 h的抑制率。殼聚糖低濃度時(shí)，抑制率隨濃度增加而提高。培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，抑制率下降。

活體控病試驗(yàn)結(jié)果表明，殼聚糖在活體條件下對(duì)黃瓜苗期猝倒病有較好的防控作用，其防控效果與殼聚糖的施用量呈正相關(guān)關(guān)系，土壤中添加0.5 g·kg－1殼聚糖對(duì)黃瓜猝倒病能起到較好的防控效果，施用量提高到1.0 g·kg－1，防控效果明顯提高，根、莖干重均顯著增加。不同產(chǎn)品殼聚糖對(duì)黃瓜猝倒病的防控效果差異顯著。同時(shí)，殼聚糖自身作為一種有機(jī)物質(zhì)，對(duì)植物的生長(zhǎng)具有明顯的促進(jìn)作用。

已有的研究表明，殼聚糖防控植物病害的機(jī)制主要有2個(gè)方面。一方面是殼聚糖對(duì)植物病原菌的直接抑制作用，殼聚糖為甲殼素的多聚陽(yáng)離子衍生物，可與病原菌細(xì)胞表面的帶負(fù)電的物質(zhì) (如蛋白質(zhì)等)相互作用，形成聚合物影響病原菌細(xì)胞膜的正常生理功能，同時(shí)殼聚糖還可直接進(jìn)入病原菌細(xì)胞內(nèi)與胞內(nèi)蛋白質(zhì)和核酸等物質(zhì)相互作用，干擾細(xì)胞正常代謝，從而抑制病原菌的生長(zhǎng)［11］;另一方面，殼聚糖還能誘導(dǎo)植物產(chǎn)生廣譜抗性的機(jī)制。施用殼聚糖直接抑制病原菌生長(zhǎng)或誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗病反應(yīng)，是提高植物對(duì)病害的抗性，減少化學(xué)農(nóng)藥施用量的有效途徑。殼聚糖無(wú)毒、無(wú)害、來(lái)源豐富，是農(nóng)產(chǎn)品無(wú)公害生產(chǎn)中極具應(yīng)用潛力和有待開(kāi)發(fā)的一種環(huán)保型農(nóng)藥和植物抗病誘導(dǎo)物，具有廣闊的應(yīng)用前景。

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