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    天然人源IgG Fab噬菌體抗體庫的構(gòu)建及多樣性分析①

    2010-07-30 13:32:48邵紅霞付永峰HiroshiTachibana程訓(xùn)佳
    中國免疫學(xué)雜志 2010年11期
    關(guān)鍵詞:重鏈人源輕鏈

    邵紅霞 章 黎 楊 彬 馮 萌 付永峰 Hiroshi Tachibana 程訓(xùn)佳

    (復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)系,上海200032)

    健康人外周血B淋巴細(xì)胞具有受抗原物質(zhì)刺 激活化,分化成效應(yīng)細(xì)胞即漿細(xì)胞從而分泌相應(yīng)抗體的潛能??贵w多樣性在免疫球蛋白的發(fā)生機(jī)制上包括了多種淋巴細(xì)胞特異的分子機(jī)制,特別是不同基因家族的重鏈V(variable)-D(Diversity)-J(joining)片段的重排與輕鏈V-J片段的重排及輕重鏈的不同組合??贵w基因重排過程中隨機(jī)發(fā)生的體細(xì)胞突變又進(jìn)一步增加了抗體的多樣性??贵w多樣性的分子發(fā)生機(jī)制為B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生無限多樣性的免疫球蛋白基因產(chǎn)物提供了理論解釋。最新數(shù)據(jù)庫資料顯示重鏈可變區(qū)基因(VH)可分成7個基因家族,VH1~VH7,其中每個基因家族之間的同源性可達(dá)80%以上[1]。一般認(rèn)為,在健康個體,VH基因的表達(dá)常取決于各基因家族的基因片段的數(shù)量,其中VH3基因家族包括了21個功能基因片段,因而最常使用(約45.6%),而VH5、VH6及VH7家族僅有1個功能基因,因而表達(dá)頻率極低[2]。然而近年來,越來越多的研究表明,免疫球蛋白基因的表達(dá)不是隨機(jī)的。無論是感染某種特定病原體的患者還是健康個體,其外周血B淋巴細(xì)胞VH基因的表達(dá)均可能有偏向選擇,表明存在特定的分子機(jī)制而非僅VH基因的陽性選擇[3]。

    此外,輕鏈基因通過與重鏈基因組合的多樣性共同影響免疫球蛋白的抗原結(jié)合部位,輕鏈基因分κ和λ兩種,一般認(rèn)為在人體內(nèi)的比例約2∶1,κ輕鏈的功能基因分屬于1~5個家族,以Vκ1基因家族最多見;λ輕鏈的功能基因包括了11個基因家族,以Vλ3家族最多見。

    基因工程抗體庫技術(shù)是近年來發(fā)展起來的體外制備人單克隆抗體的新方法,利用抗體庫技術(shù)可以篩選到針對任何抗原分子的抗體并可進(jìn)行人工改造以提高親和力等各種生物學(xué)效應(yīng)。分析已經(jīng)建成的抗體庫基因特別是VH基因可以在一定程度上反映B淋巴細(xì)胞抗體基因的多樣性及可能存在的偏向選擇,為合理使用抗體庫制備相應(yīng)抗體及進(jìn)行后續(xù)的抗體優(yōu)化提供借鑒和參考并為外周血淋巴細(xì)胞來源的抗體基因的優(yōu)勢選擇提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。故本課題收集了300名健康志愿者的外周血淋巴細(xì)胞,分別獲得人免疫球蛋白的重鏈Fd和輕鏈基因,構(gòu)建天然人源IgGFab噬菌體抗體庫。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 淋巴細(xì)胞、載體和菌株 近2個月未患感冒等感染性疾病的健康志愿者抗凝外周血300份(每份2 ml),供血者為中國人,年齡20~40歲之間,以25~30歲年齡段居多,男女比例約1∶1。

    噬菌體載體pFabICN(4.4 kb,其中酶切位點(diǎn)NheⅠ至AscⅠ為輕鏈插入位置,酶切位點(diǎn)SfiⅠ至NotⅠ為重鏈插入位置)由東海大學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供[4]。測序載體CV-1和CV-2為本實(shí)驗(yàn)室自建。電轉(zhuǎn)和普通大腸埃希菌(Escherichia coli)JM109購自大連寶生物工程(TaKaRa)公司。

    1.1.2 主要實(shí)驗(yàn)材料 葡聚糖-泛影酸鈉(瑞典Pharmacia公司);總RNA提純試劑盒(德國Qiagen公司);Gene Amp RNA PCR Kit,限制性內(nèi)切酶AscⅠ、NheⅠ、SfiⅠ、NotⅠ,100 bp Ladder DNA,1 kb Ladder DNA,Lambda HindⅢDNAMarker(美國New England公司);TaKaRa Ex Taq DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶λ Hind Ⅲ、DNA Ligation Kit Ver2.0(TaKaRa公司)等。

    1.2 方法

    1.2.1 人外周血淋巴細(xì)胞分離及總RNA提取 分批采集300份健康志愿者抗凝外周血各2 ml,分別以淋巴細(xì)胞分離液分離獲得外周血淋巴細(xì)胞后混合,以滅菌PBS洗滌后重懸細(xì)胞,共獲得約8×108個細(xì)胞,總RNA提純試劑盒提取外周血淋巴細(xì)胞總RNA。

    1.2.2 人免疫球蛋白Fd重鏈及輕鏈基因的擴(kuò)增 以Gene Amp RNA PCRKit進(jìn)行RT-PCR:先將淋巴細(xì)胞總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,然后以一組幾乎覆蓋人免疫球蛋白G(IgG)全部輕鏈或重鏈可變區(qū)編碼序列的特異性引物[5],對上述反應(yīng)產(chǎn)物行PCR以分別擴(kuò)增免疫球蛋白κ、λ輕鏈和γ重鏈Fd片段。擴(kuò)增條件為:94℃2分鐘,然后94℃0.5分鐘,55℃1分鐘,72℃1分鐘,共30個循環(huán),最終延長為72℃7分鐘,其中72℃1分鐘步驟每個循環(huán)加1秒。PCR產(chǎn)物電泳鑒定后回收純化。

    1.2.3 人源IgG Fab噬菌體抗體庫的構(gòu)建 輕鏈基因κ、λ分別以限制性內(nèi)切酶 AscⅠ、NheⅠ酶切、純化后以κ∶λ輕鏈基因7∶1混合后與噬菌體載體pFabICN連接,連接產(chǎn)物提純后溶出于4μl蒸餾水中,分2次電轉(zhuǎn)JM109感受態(tài)細(xì)胞后將轉(zhuǎn)化菌均勻涂布于含50μl氨芐青霉素的LB平板,收集所有克隆的質(zhì)粒DNA,即為輕鏈抗體庫。

    γ重鏈Fd片段基因PCR產(chǎn)物以SfiⅠ、NotⅠ酶切,純化后與輕鏈庫DNA連接,同法電轉(zhuǎn)化獲得所有克隆的質(zhì)粒DNA,即為抗體庫DNA,同時計數(shù)菌落數(shù)目以計算抗體庫效價。

    1.2.4 人源IgGFab噬菌體抗體庫的鑒定及多樣性分析 抗體庫DNA分三次轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細(xì)胞,隨機(jī)挑選克隆,提取質(zhì)粒DNA,首先以λHindⅢ酶切初步鑒定,進(jìn)一步以AscⅠ、NheⅠ或SfiⅠ、NotⅠ雙酶切后鑒定輕重鏈插入片段酶切位點(diǎn)是否正確。對輕重鏈均插入正確的質(zhì)粒,以雙酶切分別獲得輕鏈、重鏈基因片段,分別與測序載體CV-2、CV-1連接,送Invitrogen(英濰捷基貿(mào)易有限公司)以ABI 3730 DNA測序儀測定核苷酸序列并推算氨基酸序列,利用IgBLAST數(shù)據(jù)庫分析抗體基因的同源家族信息。

    2 結(jié)果

    2.1 人免疫球蛋白Fd重鏈及輕鏈基因的擴(kuò)增 來源于300份健康志愿者的外周血淋巴細(xì)胞的總RNA進(jìn)行RT-PCR,將獲得的免疫球蛋白輕鏈和γ重鏈Fd片段經(jīng)2.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定,顯示重鏈Fd基因長度約為690 bp,輕鏈κ.λ基因長度約為660 bp(圖1)。

    圖1 重鏈和輕鏈基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.1 PCR products of heavy and light chain genes

    圖2 人源IgG Fab噬菌體抗體庫Fig.2 Human phage-displayed Fab library

    2.2 人源IgGFab噬菌體抗體庫的構(gòu)建 將所有淋巴細(xì)胞來源的輕鏈基因(κ、λ)與噬菌體載體pFabICN連接建成輕鏈庫,進(jìn)一步將重鏈Fd基因片段連接于輕鏈庫DNA相應(yīng)位置中,最終獲得非依賴性克隆滴度(即庫容量)為4×108的人源IgG Fab噬菌體抗體庫??贵w庫DNA的0.8%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖2。

    2.3 抗體庫的鑒定和抗體基因分析 對三次隨機(jī)挑選克隆獲得的輕重鏈基因插入正確的32個克隆進(jìn)行輕重鏈基因測序,以IgBLAST數(shù)據(jù)庫對測序結(jié)果進(jìn)行核苷酸序列分析和氨基酸推算。在總共32條重鏈核苷酸序列中,其中2條重鏈基因較正常明顯縮短,另1條不屬于人免疫球蛋白基因,其余29條重鏈Fd基因片段彼此完全不同并能正確翻譯,占所測序列的90.6%。所有29條重鏈所對應(yīng)的輕鏈基因序列大小正常并能正常翻譯。

    經(jīng)IgBLAST比對,29條重鏈基因的V、D、J片段所屬的基因家族分布見圖3所示,其中重鏈可變區(qū)V片段中,VH3基因家族有21條,占72%,VH1基因家族3條(10.3%),VH4、VH5基因家族各 2條(各6.9%),VH7基因家族1條(3.4%)。屬于VH3基因家族的21條重鏈基因包括了3-7、3-30(各4條),3-23、3-48、3-66(各 2 條),3-9 、3-11、3-15、3-20、3-21、3-43和3-74(各1條);重鏈可變區(qū)D片段分別屬于1~6基因家族,以DH3家族最多(58.6%);重鏈可變區(qū)J片段分別屬于1~6家族,以JH4家族最多(31.0%)。29條輕鏈基因可變區(qū)V片段分別屬于Vκ1(13 條,44.8%)、Vκ2(4 條,15.4%)、Vκ3(3條,11.5%)、Vκ4(6 條 ,23.1%)基因家族和 Vλ1(3 條,11.5%)基因家族;輕鏈基因可變區(qū)J片段分別屬于Jκ1~ 2,Jκ4~ Jκ5和 Jλ3(見圖 4)。

    圖3 天然人源噬菌體抗體庫中重鏈基因家族分布圖Fig.3 Distribution of heavy chain genefamilies in a na?ve human phage-displayed Fab library

    圖4 天然人源噬菌體抗體庫中輕鏈基因家族分布圖Fig.4 Distribution of light chain gene families in a na?ve human phage-displayed Fab library

    3 討論

    抗體庫的庫容量及多樣性是衡量抗體庫質(zhì)量的重要技術(shù)指標(biāo),理論上,抗體庫容量越大,多樣性越好,篩選到針對任意抗原表位抗體的概率也就越大,親和力也可能越高。雖然由于體內(nèi)B淋巴細(xì)胞種類和數(shù)量有限,同時受克隆清除和克隆無能導(dǎo)致免疫耐受的影響,天然抗體庫的容量受限,但天然抗體庫是由經(jīng)體內(nèi)重排的抗體基因構(gòu)成,其產(chǎn)生的克隆均為有效克隆,即100%具有活性[6]。因此,對于天然抗體庫而言,廣泛的基因來源不僅有助于消除不同個體之間的差異更重要的是可以增加基因來源的多樣性,同時在建庫過程中將輕重鏈基因分別插入載體的相應(yīng)位置,有助于增加輕重鏈基因組合的多樣性,對提高抗體庫質(zhì)量意義重大。本研究以來源于300名健康志愿者的外周血淋巴細(xì)胞作為抗體庫基因的來源,有利于增加抗體庫基因來源的多樣性,為構(gòu)建高質(zhì)量的抗體庫奠定了基礎(chǔ)。增加轉(zhuǎn)化次數(shù)是增大庫容的途徑之一,Vaughan等[7]通過上百次的電轉(zhuǎn)化獲得了1.4×1010的抗體庫。然而通過這種方式獲得的大庫容抗體庫又不可避免地影響了抗體庫的多樣性。本研究在建庫過程中努力平衡庫容量和庫多樣性兩大技術(shù)指標(biāo),從控制實(shí)驗(yàn)過程中最佳反應(yīng)條件等細(xì)節(jié)因素著手,而不刻意以增加轉(zhuǎn)化次數(shù)等手段擴(kuò)庫,構(gòu)建了庫容4×108的原始抗體庫。建庫的抗體基因來源于有活性的B淋巴細(xì)胞(相比靜息的B淋巴細(xì)胞,含有更多的mRNA),又有助于提高抗體庫基因產(chǎn)物中有功能抗體的比例[8]。

    本研究對人源IgG Fab噬菌體抗體庫中隨機(jī)獲得的29條Fd重鏈基因序列的分析顯示,重鏈VH3基因家族的表達(dá)頻率最高,VH2和VH6表達(dá)頻率最低,與Tiller等[9]的研究非常近似,該研究從 3個健康人外周血中獲得183個IgG+記憶B細(xì)胞的單克隆中提取cDNA進(jìn)行分析,VH基因家族的分布頻率為:VH1(15.8%),VH2(0%),VH3(54.8%),VH4(23.5%),VH5(6%),VH6(0%),VH7(0.7%)。王晉等[10]構(gòu)建了來源于20位健康人外周血淋巴細(xì)胞的2×108庫容的噬菌體抗體庫并從該抗體庫中隨機(jī)挑選克隆46個進(jìn)行測序,發(fā)現(xiàn)重鏈VH基因家族的分布趨勢為VH1>VH4>VH3>VH6>VH2>VH5,其中VH3僅20%,與本研究結(jié)果差異較大。有關(guān)健康成人外周血B淋巴細(xì)胞VH基因的表達(dá)趨勢,多個實(shí)驗(yàn)室曾做過相關(guān)研究,Guigou等[11]采用原位雜交方式進(jìn)行的研究表明VH基因的隨機(jī)分布方式與各基因家族中功能基因的數(shù)目相關(guān),即VH3>VH4>VH1>VH5>VH6>VH2,但這種結(jié)果未被廣泛接受,Huang等利用二步PCR法分析B淋巴細(xì)胞庫發(fā)現(xiàn)不同個體存在不同的VH基因家族的偏向性[12],Davidkova等[13]也有類似發(fā)現(xiàn),該研究運(yùn)用原位雜交的方法分析8個健康成人的外周血淋巴細(xì)胞,結(jié)果發(fā)現(xiàn)各健康個體之間VH基因家族的使用頻率存在很大差異,如VH3家族多數(shù)集中在40.4%~83.3%之間,平均達(dá)57.9%,是所有基因家族中使用頻率最高的一族,唯有一人表達(dá)僅8.5%,但其表達(dá)VH6高達(dá)76.6%,而VH6是表達(dá)頻率最低的一族,VH分布頻率總體概括為:VH3>VH5>VH2>VH1>VH4>VH6。值得一提的是,外周血淋巴細(xì)胞VH基因的表達(dá)受到內(nèi)在基因和外在環(huán)境等多方面因素的影響,不同的體外分析手段、免疫球蛋白基因來源及個體之間均存在差異,導(dǎo)致在現(xiàn)有條件下很難對B淋巴細(xì)胞VH基因分布頻率進(jìn)行完全正確和全面的評估?,F(xiàn)有多數(shù)研究結(jié)果表明,健康人免疫球蛋白基因存在VH3基因家族的優(yōu)勢表達(dá),而VH6幾乎是各家族中表達(dá)最低的一族,而對于VH1、VH2、VH4及VH5的表達(dá)情況,各研究結(jié)果之間差異較大,以VH4為例,有研究認(rèn)為僅次于VH3[9],也有數(shù)據(jù)顯示其表達(dá)頻率更低[13],本研究結(jié)果介于二者之間,即VH3>VH1>VH4、VH5>VH7>VH2、VH6。VH4基因家族優(yōu)勢表達(dá)于部分自身免疫性疾病患者,健康個體可能存在VH4的陰性選擇以避免發(fā)生自身免疫性疾病[14],這是否可用來解釋健康人存在不同的陰性選擇從而導(dǎo)致VH4基因分布頻率上的不一致性尚不明確。

    本研究獲得的重鏈可變區(qū)VH片段基因分布頻率的結(jié)果與直接來源于外周血B淋巴細(xì)胞的研究結(jié)果具有較好的符合性,反映出在建庫過程中使用的一組幾乎覆蓋人IgG全部輕鏈或重聯(lián)可變區(qū)編碼序列的特異性引物確實(shí)具有較好的覆蓋性。此外,由于重鏈可變區(qū)D片段基因和J片段基因(分別屬于1~6個基因家族)分布范圍較廣,有利于V-D-J片段重排產(chǎn)生多樣性良好的重鏈基因。輕鏈可變區(qū)的V片段基因分別屬于Vκ1~4和Vλ1基因家族,以Vκ1基因家族最多見;J片段基因分別屬于Jκ1~2、Jκ4~5和Jλ3基因家族,有利于輕鏈基因V-J片段以多種排列組合方式重排。輕重鏈基因的不同組合進(jìn)一步增加了抗體的多樣性。利用抗體庫技術(shù)還可以對抗體重輕鏈可變區(qū)特別是6個互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)進(jìn)行定向突變,以獲得具有更好特異性和更強(qiáng)親和力的抗體,進(jìn)一步增加了抗體庫的多樣性,從而完善和補(bǔ)充現(xiàn)有的抗體庫。

    1 Pallarès N,Lefebvre S,Contet V et al.The human immunoglobulin heavy variablegenes[J].Exp Clin Immunogenet,1999;16:36-60.

    2 Gorny M K,Wang X H,Williams C et al.Preferential use of the VH5-51 gene segment by thehuman immune response tocode for antibodies against the V3 domain of HIV-1[J].Mol Immunol,2009;46:917-926.

    3 Brezinschek H P,Brezinschek RI,Lipsky P E.Analysisof the heavy chain repertoire of human peripheral B cells using single-cell polymerase chain reaction[J].JImmunol,1995;155:190-202.

    4 Takekoshi M,Maeda F,Tachibana H et al.Humanmonoclonal anti-HCMV neutralizing antibody from phage display libraries[J].J Virol Methods,1998;74:89-98.

    5 Tachibana H,Cheng X J,Watanabe K et al.Preparation of recombinant human monoclonal antibody Fab fragments specific for Entamoebahistolytica[J].Clin Diagn Lab Immun,1999;6(3):383-387.

    6 Sheet M D,Amersdorfer P,Finnem R et al.Efficient construction of a largenonimmune phage antibody library:the production of high-affinity human single-chain antibodies to protein antigens[J].Proc Natl Acad Sci USA,1998;95:6157-6162.

    7 Vaughan TJ,Williams SC,Pritchard K et al.Human antibodies with subnanomolar affinities isolated from a large non-immunized phage display library[J].Nat Biotechnol,1996;14:309-314.

    8 Longtenberg T,Schhutte M EM,Ebeling S B et al.Molecular approaches to the study ofhuman B cell and autoantibody repertoiregeneration and selection[J].Immunol Rev,1992;128:23-47.

    9 Tiller T,Tsuiji M,Yurasov S et al.Autoreactivity in human IgG+memory B cells[J].Immunity,2007;26:205-213.

    10 王 晉,羅文新,李利峰 et al.多樣性人源天然噬菌體抗體庫的構(gòu)建及初步應(yīng)用[J].細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志,2006;22(6):786-793.

    11 Guigou V,Cuisinier A M,Tonnelle C et al.Human immunoglobulin VH and V repertoire revealed by in situ hybridization[J].Mol Immunol,1990;27:935-940.

    12 Huang C,Stewart A K,Schwartz RS et al.Immunologlobulin heavy chain geneexpression in peripheral blood B lymphocytes[J].J Clin Invest,1992;89:1331-1343.

    13 Davidkova G,Pettersson S,Holmberg D et al.Selective usage of VH genes in adult human B lymphocyte repertoires[J].Scand J Immunol,1997;45:62-73.

    14 Pugh-Bernard A E,Sliverman G J,Cappione A J et al.Regulation of inherently autoreactive VH4-34 B cellsin themaintenanceof human B cell tolerance[J].J Clin Invest,2001;108:1061-1070.

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