番茄紅素對(duì)大鼠非酒精性脂肪肝的作用研究

魏 來(lái)，趙春景

（重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院藥劑科，重慶 400010）

番茄紅素是一種天然的生物抗氧化劑和功能性色素，具有保肝和抗急性肝損傷的作用[1]。它還具有多種生物學(xué)活性，其中調(diào)節(jié)血脂的作用正日益受到關(guān)注[2-3]。本研究通過(guò)建立非酒精性脂肪肝動(dòng)物模型，了解番茄紅素對(duì)大鼠非酒精性脂肪肝的防治作用及其可能的作用機(jī)制，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

儀器：UV-1601型紫外分光光度計(jì)（日本島津公司）；AEG-220型電子天平（日本島津公司）；TJ-6型低溫離心機(jī)（日本Olympus公司）；低溫冰箱（日本Sanyo公司）；恒溫水浴箱（成都醫(yī)療器械二廠）；玻璃勻漿器（涿州市長(zhǎng)虹玻璃儀器廠）；HY-9211K型恒溫振蕩器（太倉(cāng)市科教器材廠）。

藥品與試劑：番茄紅素油樹(shù)脂（純度為6%，新疆生命紅紅花開(kāi)發(fā)有限責(zé)任公司，批號(hào)為20040302，使用時(shí)用色拉油將番茄紅素油樹(shù)脂稀釋成25 g/L，備用）；超氧化物歧化酶（SOD，批號(hào)為20050216）及丙二醛（MDA，批號(hào)為20050324）試劑盒，蛋白定量試劑盒（雙縮脲法，批號(hào)為20050201），脂蛋白酯酶（LPL）試劑盒（批號(hào)為 20050211），肝脂酶（HL）試劑盒（批號(hào)為 20050211），膽堿酯酶（CHE）試劑盒（批號(hào)為20050325），均購(gòu)于南京建成生物工程研究所；膽固醇（批號(hào)為20040605，上海生物化學(xué)公司）。

動(dòng)物：Wistar大鼠，清潔級(jí)，雄性，60 只，體重（150 ±10）g，由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 試驗(yàn)方法

動(dòng)物分組：將60只大白鼠正常喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為5組。正常對(duì)照組（N組）10只，給予正常飼料。造模組50只，給予高脂飼料（88%普通飼料，10%豬油，2%膽固醇）[4-5]連續(xù)8周后，處死其中10只，做肝臟病理切片。HE染色顯微鏡下，10只大鼠肝臟病理切片均可見(jiàn)單位面積上超過(guò)1/3的肝細(xì)胞脂肪變性，肝細(xì)胞明顯腫大，確定脂肪肝動(dòng)物模型成功，將另40只造模大鼠隨機(jī)分為4組，即模型對(duì)照組（M組），繼續(xù)給予高脂飼料；低劑量組（L組）、高劑量組（H組），改食普通飼料，每天給予番茄紅素（L組10 mg/kg，H組20 mg/kg）灌胃；自然恢復(fù)組（NR組），改食普通飼料，同時(shí)給予同體積的色拉油灌胃。均連續(xù)給藥4周。

測(cè)定指標(biāo)和方法：于連續(xù)用藥4周末處死全部動(dòng)物并檢查。處死前稱(chēng)重，禁食不禁水（停藥），24 h后腹腔注射2%異戊巴比妥70 mg/kg；麻醉動(dòng)物后眼眶取血，3000 r/min離心15 min，分離血清，-20℃冰箱保存。打開(kāi)腹腔，摘取肝臟，置天平上稱(chēng)重，然后取部分肝臟用生理鹽水漂洗數(shù)次后，濾紙拭干；稱(chēng)取0.5～0.6 g，加入冰生理鹽水5～6 mL，用玻璃勻漿器在冰水中進(jìn)行碾磨勻漿，制成10%勻漿；10000 r/min 4℃離心30 min，取上清，-20℃冰箱保存。另取部分肝右葉，用10%甲醛固定，石蠟包埋，切片，HE染色，作肝臟病理組織學(xué)檢查。

1.3 數(shù)據(jù)表達(dá)和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。進(jìn)行方差分析和兩兩比較的 t檢驗(yàn)，P＜0.05表示有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)大鼠肝功能及血脂的影響

結(jié)果見(jiàn)表1。與N組比較，M組天門(mén)冬酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）及谷氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）水平均明顯升高（P＜0.01），甘油三酯（TG）、膽固醇（CHO）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、游離脂肪酸（FFA）均明顯升高，高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）下降（P＜0.01）；與NR組比較，不同劑量的番茄紅素（L組及H組）均能抑制因造模引起的AST及ALT水平升高（P＜0.05或 P＜0.01），且呈一定的劑量依賴(lài)趨勢(shì)；與M組比較，不同劑量的番茄紅素組（L組及H組）血TG，CHO，LDL-C及 FFA下降，HDL-C升高（P＜0.05或 P＜0.01）。

表1 番茄紅素對(duì)非酒精性脂肪肝大鼠肝功能及血脂的影響（,n=10）

表1 番茄紅素對(duì)非酒精性脂肪肝大鼠肝功能及血脂的影響（,n=10）

注：與 N 組比較，*P ＜0.01；與 NR 組比較，△P ＜0.05，▲P ＜0.01；與 M 組比較，#P ＜0.05，■P ＜0.01（下表同）。

組別 劑量[mg/（kg·d）]N組M組NR組L組H組肝功能（U/L）血脂（mmol/L）FFA 0.84±0.151.92±0.16*1.75±0.101.55±0.07#1.34±0.07#---1020 AST 175.4±14.52235.1±23.75*219.0±16.40*208.6±15.15Δ 192.2±16.03▲ALT 43.7±4.8373.1±6.49*68.5±7.56*53.1±5.51Δ 49.8±6.78▲TG 0.60±0.051.62±0.06*1.17±0.071.04±0.06#0.81±0.08#CHO 1.43±0.713.67±0.85*3.01±0.682.15±0.94#1.88±0.85■LDL-C 0.34±0.122.32±0.11*1.83±0.121.14±0.13#0.71±0.06■HDL-C 0.95±0.070.57±0.07*0.83±0.020.74±0.03#0.70±0.03#

2.2 番茄紅素對(duì)大鼠肝組織勻漿SOD，MDA，CHE及血清CHE的影響

結(jié)果見(jiàn)表2。與N組比較，M組SOD活性明顯降低，MDA含量明顯升高（P＜0.01），血清中 CHE 活性明顯升高（P＜0.01）；與NR組比較，不同劑量的番茄紅素組（L組及H組）SOD活性明顯升高，MDA含量明顯降低（P＜0.05或 P＜0.01），血清中CHE活性明顯降低（P＜0.05或 P＜0.01）；而肝組織中CHE的變化與血清中的變化相同。

表2 番茄紅素對(duì)非酒精性脂肪肝大鼠組織勻漿SOD，MDA，CHE及血清CHE的影響（,n=10）

表2 番茄紅素對(duì)非酒精性脂肪肝大鼠組織勻漿SOD，MDA，CHE及血清CHE的影響（,n=10）

組別N組M組NR組L組H組劑量[mg/（kg·d）]---1020 SOD（U/mgprot）101.78±11.7766.63±8.98*78.86±5.5270.80±6.72Δ 86.24±5.46▲MDA（NU/mgprot）3.09±0.595.49±0.93*4.87±0.764.23±0.70Δ 3.53±0.50Δ血清中CHE（U/mL）61.36±7.44111.31±11.44*99.48±10.7784.46±8.03▲75.79±8.76▲組織中CHE（U/mgprot）11.44±1.6739.36±2.67*30.58±3.6325.21±2.19Δ 19.15±1.94▲

2.3 肝組織病理學(xué)檢查

N組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝索排列規(guī)則，肝細(xì)胞形態(tài)正常。M組大鼠均出現(xiàn)重度脂肪變性，肝細(xì)胞明顯腫大，胞漿內(nèi)充滿(mǎn)以大泡型為主的脂肪空泡或脂滴，并伴有肝細(xì)胞的變性及壞死；脂肪變細(xì)胞以中央靜脈周?chē)^明顯，呈極度腫脹，肝竇狹窄，未見(jiàn)纖維間隔形成。與M組比較，NR組、L組和H組大鼠肝脂肪變性程度和炎癥均有不同程度的改善，其中以L組和H組改善較為顯著。肝細(xì)胞脂肪變性計(jì)分參考文獻(xiàn)[6]。肝細(xì)胞脂肪變性程度分級(jí)：“+”表示肝細(xì)胞脂肪變性程度不超過(guò)25%；“++”表示肝細(xì)胞脂肪變性程度在25%～50%之間；“+++”表示肝細(xì)胞脂肪變性程度在50% ～75%之間；“++++”表示肝細(xì)胞脂肪變性程度超過(guò)75%。計(jì)分時(shí)，“+”～“++++”依次視為1～4分。炎癥活動(dòng)度的計(jì)分參考Knodell的計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)[7]，匯管區(qū)和小葉內(nèi)炎癥程度分別計(jì)分，兩者之和為每張切片的炎癥活動(dòng)度計(jì)分。具體計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)為：匯管區(qū)或小葉內(nèi)無(wú)炎癥、壞死，計(jì)0分；小于1/3的匯管區(qū)或小葉內(nèi)有炎癥、壞死，計(jì)1分；1/3～2/3的匯管區(qū)或小葉內(nèi)有炎癥、壞死，計(jì)3分；超過(guò)2/3的匯管區(qū)或小葉內(nèi)有炎癥、壞死，計(jì)4分。參考文獻(xiàn)[8]，每張切片隨機(jī)選取3個(gè)視野，每個(gè)視野將脂肪變性與炎癥活動(dòng)度分別計(jì)分，取其平均值。各組脂肪變性程度、炎癥活動(dòng)度和計(jì)分見(jiàn)圖1及表3。

圖1 番茄紅素對(duì)非酒精性脂肪肝大鼠肝臟病理改變的影響（200倍光鏡，HE染色）

表3 非酒精性脂肪肝大鼠肝臟病理學(xué)改變

3 討論

非酒精性脂肪肝的相關(guān)病因很多，臨床上主要指與肥胖、糖尿病和高脂血癥相關(guān)的因素。其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及細(xì)胞內(nèi)的生化代謝，具體環(huán)節(jié)尚不完全清楚，一般認(rèn)為與脂肪代謝異常、激素影響、環(huán)境因素、遺傳因素、氧應(yīng)激及脂質(zhì)過(guò)氧化損傷、免疫反應(yīng)、肝竇改變等有關(guān)[9]，故臨床上常用調(diào)脂藥治療脂肪肝。一些調(diào)脂藥對(duì)脂肪肝有效[10-11]，但許多調(diào)脂藥雖然調(diào)脂效果確切卻具有潛在的肝毒性，對(duì)肝內(nèi)脂肪沉積無(wú)改善甚至反而加重肝損傷[12-13]，因此兼有調(diào)脂和保肝雙重作用的藥物會(huì)更有利于脂肪肝的防治。番茄紅素是一種類(lèi)胡蘿卜素，具有強(qiáng)大的抗氧化、調(diào)節(jié)血脂、抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞間隙連接通訊、增強(qiáng)機(jī)體免疫、調(diào)節(jié)環(huán)加氧酶新陳代謝等作用。

本試驗(yàn)成功建立了非酒精性脂肪肝模型，并在高脂膳食的同時(shí)應(yīng)用番茄紅素干預(yù)脂肪肝。結(jié)果顯示，番茄紅素能降低血清和肝組織中的脂質(zhì)水平，減少FFA的生成，從而保護(hù)肝細(xì)胞；能明顯抑制氧應(yīng)激和脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，促使氧化與抗氧化機(jī)制恢復(fù)平衡，從而使肝臟免受損害；能減輕高脂飲食誘導(dǎo)的肝細(xì)胞活動(dòng)性損傷，從而起到保護(hù)肝細(xì)胞的作用；還可減輕肝臟的炎性損傷和脂肪變性程度，使肝細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能逐漸恢復(fù)正常。因此，番茄紅素可認(rèn)為同時(shí)兼有保肝和調(diào)脂的雙重效應(yīng)，其作用機(jī)制可能是：抑制自由基的生成和抗脂質(zhì)過(guò)氧化；調(diào)節(jié)脂肪代謝，調(diào)節(jié)血脂水平，減少FFA的生成。

[1]魏 來(lái)，趙春景.番茄紅素對(duì)急性肝損傷模型大鼠的保護(hù)作用[J].中國(guó)藥房，2007，18（4）：258-260.

[2]Agarwal S，Rao AV.Tomato lycopene and its role in human health and chronic diseases[J].CMAJ，2000，163（6）：739-744.

[3]Rosati C，Aquilani R，Dharmapuri S，et al.Metabolic engineering of betacarotene and lycopene content in tomato fruit[J].Plant J，2000，24（3）：413-419.

[4]孫大裕.脂肪肝動(dòng)物模型的研究進(jìn)展[J].中華消化雜志，2002，22（5）：305-306.

[5]楊華秀，劉 鵬，夏國(guó)棟，等.降脂顆粒治療脂肪肝的臨床與實(shí)驗(yàn)研究[J]. 中華臨床醫(yī)藥，2003，4（2）：6-8.

[6]Keengan A，Martini R，Batey R.Ethanol-related liver injury in the rat：a model of steatosis，inflammation and pericentral fibrosis[J].Hepatology，1995，23：591-600.

[7]Yin M，Wheeler MD，Kono H，et al.Essential role of tumor necrosis factor α in alcohol-induced liver injury in mice[J].Gastroenterology，1999，117（4）：942-952.

[8]閻 明，孟繁立，呂瑞娟，等.非諾貝特治療酒精性與藥物性脂肪肝的實(shí)驗(yàn)研究[J]. 中華肝臟病雜志，2003，11（2）：86-90.

[9]Adams LA，Angulo P，Lindor KD.Nonalcoholic fatty liver disease[J].Can Med Assoc J，2005，173（7）：734-745.

[10]Siebler J，Galle PR.Treatment of nonalcoholic fatty liver disease[J].World Gastroenterol，2006，12（14）：2161-2167.

[11]Adams LA.Angulo Treatment of non-alcoholic fatty liver disease[J].J Postgrad Med，2006，82：315-322.

[12]張英霞，李震坤.脂肪肝的研究現(xiàn)狀[J].內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)雜志，2006，38（5）：459-461.

[13]劉懷昌，嚴(yán)俊儒，徐 寧.阿托伐他汀與氟伐他汀對(duì)老年高脂血癥強(qiáng)化降脂治療的療效和安全性觀察[J].中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2006，14：133-137.