張 濤, 潘 峰, 陳建永, 王小平, 施 斌
(1.廣州中醫(yī)藥大學(xué),廣東廣州510405;2.杭州市紅會(huì)醫(yī)院,浙江杭州310003;3.江西中醫(yī)藥高等專科學(xué)校,江西臨川344700;4.杭州市第一人民醫(yī)院,浙江杭州310000)
潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis,UC)是一種原因尚不明確、反復(fù)發(fā)作,腸道非特異性炎癥性疾病。該病的發(fā)病機(jī)制尚不明確,但研究表明,黏蛋白的分泌和硫酸化的異常在UC的發(fā)生、發(fā)展中占據(jù)重要地位[1]。TNBs單劑灌腸誘導(dǎo)大鼠結(jié)腸炎模型,不需預(yù)先致敏動(dòng)物或進(jìn)行外科手術(shù),而且損傷可以復(fù)制,具有簡(jiǎn)單易行,重現(xiàn)性好,與人類UC相似的特點(diǎn),是UC發(fā)病機(jī)制研究及防治藥物療效評(píng)估的比較理想的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型[2]。本課題在中醫(yī)藥理論指導(dǎo)下,以公認(rèn)有效的美沙拉嗪為陽(yáng)性對(duì)照,觀察馬齒莧多糖緩解TNBs誘導(dǎo)大鼠結(jié)腸炎的實(shí)驗(yàn)研究。
1.1 實(shí)驗(yàn)材料 清潔級(jí)♂性SD大鼠48只,體重為(200±20)g,浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。美沙拉嗪(商品名惠迪,佳木斯鹿靈制藥有限公司生產(chǎn),批號(hào)H19980148),5%2,4,6TNBs,購(gòu)自 Sigma 公司(貨號(hào):P2297)。無(wú)水乙醇購(gòu)自上海國(guó)藥集團(tuán)。HID-AB(高鐵雙胺-奧辛藍(lán))、AB-PAS(過(guò)碘夫酸-奧辛藍(lán))黏蛋白特殊染色試劑購(gòu)自上海鈺森生物試劑有限公司。
馬齒莧多糖提取:稱取粉碎的馬齒莧干品粉末10 g,甲醇回流脫去表面脂肪,抽濾,藥渣風(fēng)干。再用80%乙醇回流除去小分子糖、苷類、生物堿等,藥渣風(fēng)干。然后分別取藥渣5 g,以水作為溶劑對(duì)藥渣進(jìn)行多糖提取。水提液離心去除雜質(zhì),減壓濃縮至小體積,加無(wú)水乙醇至濃度75%沉淀;靜置24 h后過(guò)濾,用95%乙醇、無(wú)水乙醇、丙酮洗滌數(shù)次,真空干燥,得馬齒莧多糖(polysaccharide of Portulaca oleracea,POP),用蒽酮-硫酸比色法檢測(cè)多糖含量為8.5%,60℃烘干備用。得率為10 g×8.5%=0.85 g。
1.2 方法
1.2.1 大鼠UC模型復(fù)制:所有SD大鼠稱重后,按體重隨機(jī)分4組,其中正常組12例,模型組12例,中藥治療組12例,西藥對(duì)照組12例。除正常組外,其余36只SD大鼠先給予25%烏拉坦,按0.35 mL/100 g腹腔麻醉。參照Morris GP法改良[3]TNBs造模最佳劑量100 mg/kg計(jì)算,用1 mL注射器抽吸TNBs原液(0.18 mL/100 gSD大鼠),繼續(xù)抽吸0.25 mL的50%乙醇混合后,用聚丙烯管插入肛門(mén)上段8 cm后注入混合試劑,倒置夾肛2 h。6 h后觀察造模動(dòng)物,約75%大鼠出現(xiàn)稀便和血便。3 d后除正常組同步飼養(yǎng)外,模型組予0.33 mL生理鹽水灌胃,中藥治療組予POP水溶液200 mg/0.33 mL灌胃,西藥對(duì)照組予美沙拉嗪水溶液22 mg/0.33 mL灌胃,連續(xù)用藥7 d[4]。各組治療結(jié)束后處死動(dòng)物。迅速剖取距肛8 cm遠(yuǎn)端結(jié)腸,置于10%中性甲醛液固定。
1.2.2 HE染色觀察組織學(xué)損傷評(píng)分:將已用10%中性甲醛固定好的大鼠結(jié)腸取出,然后切取病變處,經(jīng)用流水沖洗,放入生物脫水機(jī)進(jìn)行逐級(jí)脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋切片4 μm,常規(guī)HE染色,封片,光鏡下觀察炎癥和潰瘍情況。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)[5],具體見(jiàn)表1。
表1 UC光鏡下結(jié)腸組織損傷評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)
1.2.3 結(jié)腸黏蛋白特殊染色:采用HID-AB、AB-PAS法,具體步驟嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作。
2.1 結(jié)腸黏膜損傷情況和損傷評(píng)分比較 模型組肉眼可見(jiàn)結(jié)腸黏膜糜爛重,潰瘍表淺多而且大;光鏡下見(jiàn)黏膜嚴(yán)重充血、水腫,大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn),潰瘍周?chē)南袤w擴(kuò)張,腺上皮細(xì)胞輕度增生。中藥治療組肉眼可見(jiàn)結(jié)腸黏膜糜爛程度減輕,潰瘍小,黏膜充血;光鏡下見(jiàn)愈合性小潰瘍,黏膜及黏膜下層輕度充血、水腫,炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。西藥對(duì)照組肉眼可見(jiàn)結(jié)腸黏膜糜爛程度減輕,潰瘍數(shù)量少,水腫程度較模型組輕淺;光鏡下結(jié)腸壁黏膜面見(jiàn)愈合性小潰瘍,腸壁各層充血、水腫,炎性細(xì)胞浸潤(rùn),見(jiàn)表2。
表2 大鼠UC結(jié)腸組織損傷評(píng)分(±s)
表2 大鼠UC結(jié)腸組織損傷評(píng)分(±s)
注:經(jīng)F檢驗(yàn),治療組與模型組比較,△P<0.01;對(duì)照組與模型組比較,*P<0.01;治療組與模型組對(duì)比,P>0.05。
組別 例數(shù) 肉眼損傷評(píng)分 光鏡損傷評(píng)分正常組12 0 0模型組 12 7.36±0.27 4.45±0.20治療組 12 2.46±0.15△ 3.12±0.12△對(duì)照組 12 2.58±0.10* 3.23±0.14*
2.2 結(jié)腸黏蛋白特殊染色結(jié)果 采用Image-pro PLUS 4.1版圖像分析軟件,每個(gè)樣本隨機(jī)選取3個(gè)高倍視野,采用灰度值120~145,計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的百分比,對(duì)結(jié)腸黏膜黏蛋白的表達(dá)進(jìn)行定量分析。模型組大鼠結(jié)腸黏蛋白分泌減少,治療組大鼠結(jié)腸黏蛋白分泌增加,兩組比較,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)表3。
臨床研究發(fā)現(xiàn),以馬齒莧為君藥的中藥復(fù)方清腸栓治療潰瘍性結(jié)腸炎療效顯著[6]。但馬齒莧具體有效成分尚不明確,因而本研究在前期工作的基礎(chǔ)上,開(kāi)展馬齒莧有效部位的研究。馬齒莧為馬齒莧科植物馬齒莧(Portulaca oleracea L.)的干燥地上部分,首載于《神農(nóng)本草經(jīng)》。《本草綱目》記載:“其葉并比如馬齒,而性滑利似莧,故名?!庇置R齒草,春夏二季采收,除去殘根及雜質(zhì),洗凈,略蒸或燙后曬干。性味酸寒,歸肝、大腸經(jīng)。功效主治:清熱解毒,涼血止血。《食療本草》指出其能“煮粥止痢及疳痢”。POP為馬齒莧提取物的有效成分,具有顯著提高正常家兔淋巴細(xì)胞和PHA誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞的增殖能力,通過(guò)提高細(xì)胞免疫功能,從而調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能[7]。本研究通過(guò)組織形態(tài)學(xué)評(píng)分發(fā)現(xiàn)模型組大鼠結(jié)腸潰瘍較多而且表淺,結(jié)腸黏膜明顯充血、水腫,大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn);治療組予POP干預(yù)7 d后,鏡下觀察大鼠結(jié)腸未見(jiàn)明顯潰瘍,結(jié)腸黏膜輕度充血、水腫,少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。治療組與對(duì)照組療效相似,表明POP具有明確緩解大鼠實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎的效應(yīng)。
表3 大鼠結(jié)腸黏蛋白特殊染色分析(±s)
表3 大鼠結(jié)腸黏蛋白特殊染色分析(±s)
注:經(jīng)F檢驗(yàn),治療組與模型組相比,*P<0.01;對(duì)照組與模型組比較,△P<0.01;治療組與對(duì)照比較,P>0.05。
/%AB-PAS 0.16±0.03 0.06±0.03 0.12±0.01 0.13±0組別 正常組/% 模型組/% 治療組/% 對(duì)照組.01 HID-AB 0.13±0.02 0.05±0.010.10±0.02* 0.11±0.01△
晚近研究提示,UC與黏蛋白合成、分泌異常密切相關(guān)[8]。結(jié)腸黏蛋白是一種由柱狀上皮細(xì)胞和結(jié)腸杯狀細(xì)胞分泌的糖蛋白,起保護(hù)結(jié)腸黏膜的作用;它由寡糖通過(guò)O-糖苷鍵與黏液蛋白骨架上的絲氨酸或蘇氨酸殘基結(jié)合而成的。黏蛋白在上皮細(xì)胞表面形成具有潤(rùn)滑作用并抵抗機(jī)械破壞及腸腔內(nèi)有害物質(zhì)侵襲的保護(hù)層。與胃、小腸的黏蛋白相比,結(jié)腸的黏蛋白硫酸化程度明顯增高,硫酸化后的黏蛋白能抵制腸腔內(nèi)細(xì)菌對(duì)黏液的酶解作用,從而更好地保護(hù)結(jié)腸黏膜,故在結(jié)腸中硫酸化后的黏蛋白更為重要,黏蛋白硫酸化程度的降低對(duì)結(jié)腸黏膜膠體層中的黏液是極其不利的[9]。
本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),模型組大鼠結(jié)腸黏膜杯狀細(xì)胞數(shù)目減少、杯狀細(xì)胞中黏蛋白合成減少、黏液膠體層變薄、黏蛋白硫酸化的程度也降低,且黏蛋白減少量與局部炎癥程度有關(guān),炎癥越嚴(yán)重,黏蛋白減少越明顯;予POP干預(yù)7 d后,杯狀細(xì)胞的數(shù)目及其黏蛋白分泌的表現(xiàn)均見(jiàn)明顯恢復(fù)。這表明POP可能通過(guò)刺激結(jié)腸黏蛋白的合成及分泌,促進(jìn)TNBs所致大鼠結(jié)腸炎損傷黏膜的修復(fù)和潰瘍愈合。
[1]Amit-Romach E,Reifen R,Uni Z.Mucosal function in rat jejunum and ileum is altered by induction of colitis[J].Int J Mol Med.2006,18(4):721-727.
[2]張 濤,謝建群.大鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合消化雜志.2006,14(4):240-242.
[3]Morris G P,Beck P L,Herridge M S,et al.Hapten-induced model of chronic inflammation and ulceration in the rat colon[J].Gastroenterology,1989,96(3):795-803.
[4]徐叔云,卞如濂,陳 修主編.藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2002,1860-1861.
[5]王 皓,歐陽(yáng)欽,胡仁偉.三硝基苯磺酸結(jié)腸炎動(dòng)物模型的建立[J].胃腸病學(xué),2001,6(1):7-10.
[6]謝建群,張 濤,施斌等.清腸栓治療潰瘍性結(jié)腸炎的臨床和實(shí)驗(yàn)研究述評(píng)[J].上海中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào).2008,22(1):70-72.
[7]盧新華,何軍山,朱湘忠.馬齒莧多糖對(duì)小鼠免疫功能影響的研究[J].中藥藥理與臨床,2006,22(3):89-90.
[8]Sylvester PA,Wong NA,Myerscough N,et al.Mucin expression in the ileoanal reservoir reflects incomplete mucosal adaptation[J].J Pathol.2002,197(1):28-36.
[9]Krimi RB,Kotelevets L,Dubuquoy L,et al.Resistin-like molecule beta regulates intestinal mucous secretion and curtails TNBS-induced colitis in mice[J].Inflamm Bowel Dis,2008,14(7):931-41.