大鼠實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎結(jié)腸黏蛋白分泌異常及馬齒莧多糖干預(yù)研究

張 濤， 潘 峰， 陳建永， 王小平， 施 斌

(1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東廣州510405;2.杭州市紅會(huì)醫(yī)院，浙江杭州310003;3.江西中醫(yī)藥高等專科學(xué)校，江西臨川344700;4.杭州市第一人民醫(yī)院，浙江杭州310000)

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)是一種原因尚不明確、反復(fù)發(fā)作，腸道非特異性炎癥性疾病。該病的發(fā)病機(jī)制尚不明確，但研究表明，黏蛋白的分泌和硫酸化的異常在UC的發(fā)生、發(fā)展中占據(jù)重要地位［1］。TNBs單劑灌腸誘導(dǎo)大鼠結(jié)腸炎模型，不需預(yù)先致敏動(dòng)物或進(jìn)行外科手術(shù)，而且損傷可以復(fù)制，具有簡(jiǎn)單易行，重現(xiàn)性好，與人類UC相似的特點(diǎn)，是UC發(fā)病機(jī)制研究及防治藥物療效評(píng)估的比較理想的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型［2］。本課題在中醫(yī)藥理論指導(dǎo)下，以公認(rèn)有效的美沙拉嗪為陽(yáng)性對(duì)照，觀察馬齒莧多糖緩解TNBs誘導(dǎo)大鼠結(jié)腸炎的實(shí)驗(yàn)研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 清潔級(jí)♂性SD大鼠48只，體重為(200±20)g，浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。美沙拉嗪(商品名惠迪，佳木斯鹿靈制藥有限公司生產(chǎn)，批號(hào)H19980148)，5%2，4，6TNBs，購(gòu)自 Sigma 公司(貨號(hào):P2297)。無(wú)水乙醇購(gòu)自上海國(guó)藥集團(tuán)。HID-AB(高鐵雙胺-奧辛藍(lán))、AB-PAS(過(guò)碘夫酸-奧辛藍(lán))黏蛋白特殊染色試劑購(gòu)自上海鈺森生物試劑有限公司。

馬齒莧多糖提取:稱取粉碎的馬齒莧干品粉末10 g，甲醇回流脫去表面脂肪，抽濾，藥渣風(fēng)干。再用80%乙醇回流除去小分子糖、苷類、生物堿等，藥渣風(fēng)干。然后分別取藥渣5 g，以水作為溶劑對(duì)藥渣進(jìn)行多糖提取。水提液離心去除雜質(zhì)，減壓濃縮至小體積，加無(wú)水乙醇至濃度75%沉淀;靜置24 h后過(guò)濾，用95%乙醇、無(wú)水乙醇、丙酮洗滌數(shù)次，真空干燥，得馬齒莧多糖(polysaccharide of Portulaca oleracea，POP)，用蒽酮-硫酸比色法檢測(cè)多糖含量為8.5%，60℃烘干備用。得率為10 g×8.5%=0.85 g。

1.2 方法

1.2.1 大鼠UC模型復(fù)制:所有SD大鼠稱重后，按體重隨機(jī)分4組，其中正常組12例，模型組12例，中藥治療組12例，西藥對(duì)照組12例。除正常組外，其余36只SD大鼠先給予25%烏拉坦，按0.35 mL/100 g腹腔麻醉。參照Morris GP法改良［3］TNBs造模最佳劑量100 mg/kg計(jì)算，用1 mL注射器抽吸TNBs原液(0.18 mL/100 gSD大鼠)，繼續(xù)抽吸0.25 mL的50%乙醇混合后，用聚丙烯管插入肛門(mén)上段8 cm后注入混合試劑，倒置夾肛2 h。6 h后觀察造模動(dòng)物，約75%大鼠出現(xiàn)稀便和血便。3 d后除正常組同步飼養(yǎng)外，模型組予0.33 mL生理鹽水灌胃，中藥治療組予POP水溶液200 mg/0.33 mL灌胃，西藥對(duì)照組予美沙拉嗪水溶液22 mg/0.33 mL灌胃，連續(xù)用藥7 d［4］。各組治療結(jié)束后處死動(dòng)物。迅速剖取距肛8 cm遠(yuǎn)端結(jié)腸，置于10%中性甲醛液固定。

1.2.2 HE染色觀察組織學(xué)損傷評(píng)分:將已用10%中性甲醛固定好的大鼠結(jié)腸取出，然后切取病變處，經(jīng)用流水沖洗，放入生物脫水機(jī)進(jìn)行逐級(jí)脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋切片4 μm，常規(guī)HE染色，封片，光鏡下觀察炎癥和潰瘍情況。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)［5］，具體見(jiàn)表1。

表1 UC光鏡下結(jié)腸組織損傷評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

1.2.3 結(jié)腸黏蛋白特殊染色:采用HID-AB、AB-PAS法，具體步驟嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)腸黏膜損傷情況和損傷評(píng)分比較 模型組肉眼可見(jiàn)結(jié)腸黏膜糜爛重，潰瘍表淺多而且大;光鏡下見(jiàn)黏膜嚴(yán)重充血、水腫，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，潰瘍周?chē)南袤w擴(kuò)張，腺上皮細(xì)胞輕度增生。中藥治療組肉眼可見(jiàn)結(jié)腸黏膜糜爛程度減輕，潰瘍小，黏膜充血;光鏡下見(jiàn)愈合性小潰瘍，黏膜及黏膜下層輕度充血、水腫，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。西藥對(duì)照組肉眼可見(jiàn)結(jié)腸黏膜糜爛程度減輕，潰瘍數(shù)量少，水腫程度較模型組輕淺;光鏡下結(jié)腸壁黏膜面見(jiàn)愈合性小潰瘍，腸壁各層充血、水腫，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，見(jiàn)表2。

表2 大鼠UC結(jié)腸組織損傷評(píng)分(±s)

表2 大鼠UC結(jié)腸組織損傷評(píng)分(±s)

注:經(jīng)F檢驗(yàn)，治療組與模型組比較，△P<0.01;對(duì)照組與模型組比較，*P<0.01;治療組與模型組對(duì)比，P>0.05。

組別 例數(shù) 肉眼損傷評(píng)分 光鏡損傷評(píng)分正常組12 0 0模型組 12 7.36±0.27 4.45±0.20治療組 12 2.46±0.15△ 3.12±0.12△對(duì)照組 12 2.58±0.10* 3.23±0.14*

2.2 結(jié)腸黏蛋白特殊染色結(jié)果 采用Image-pro PLUS 4.1版圖像分析軟件，每個(gè)樣本隨機(jī)選取3個(gè)高倍視野，采用灰度值120～145，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的百分比，對(duì)結(jié)腸黏膜黏蛋白的表達(dá)進(jìn)行定量分析。模型組大鼠結(jié)腸黏蛋白分泌減少，治療組大鼠結(jié)腸黏蛋白分泌增加，兩組比較，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)表3。

3 討論

臨床研究發(fā)現(xiàn)，以馬齒莧為君藥的中藥復(fù)方清腸栓治療潰瘍性結(jié)腸炎療效顯著［6］。但馬齒莧具體有效成分尚不明確，因而本研究在前期工作的基礎(chǔ)上，開(kāi)展馬齒莧有效部位的研究。馬齒莧為馬齒莧科植物馬齒莧(Portulaca oleracea L.)的干燥地上部分，首載于《神農(nóng)本草經(jīng)》。《本草綱目》記載:“其葉并比如馬齒，而性滑利似莧，故名?！庇置R齒草，春夏二季采收，除去殘根及雜質(zhì)，洗凈，略蒸或燙后曬干。性味酸寒，歸肝、大腸經(jīng)。功效主治:清熱解毒，涼血止血。《食療本草》指出其能“煮粥止痢及疳痢”。POP為馬齒莧提取物的有效成分，具有顯著提高正常家兔淋巴細(xì)胞和PHA誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞的增殖能力，通過(guò)提高細(xì)胞免疫功能，從而調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能［7］。本研究通過(guò)組織形態(tài)學(xué)評(píng)分發(fā)現(xiàn)模型組大鼠結(jié)腸潰瘍較多而且表淺，結(jié)腸黏膜明顯充血、水腫，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn);治療組予POP干預(yù)7 d后，鏡下觀察大鼠結(jié)腸未見(jiàn)明顯潰瘍，結(jié)腸黏膜輕度充血、水腫，少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。治療組與對(duì)照組療效相似，表明POP具有明確緩解大鼠實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎的效應(yīng)。

表3 大鼠結(jié)腸黏蛋白特殊染色分析(±s)

表3 大鼠結(jié)腸黏蛋白特殊染色分析(±s)

注:經(jīng)F檢驗(yàn)，治療組與模型組相比，*P<0.01;對(duì)照組與模型組比較，△P<0.01;治療組與對(duì)照比較，P>0.05。

/%AB-PAS 0.16±0.03 0.06±0.03 0.12±0.01 0.13±0組別 正常組/% 模型組/% 治療組/% 對(duì)照組.01 HID-AB 0.13±0.02 0.05±0.010.10±0.02* 0.11±0.01△

晚近研究提示，UC與黏蛋白合成、分泌異常密切相關(guān)［8］。結(jié)腸黏蛋白是一種由柱狀上皮細(xì)胞和結(jié)腸杯狀細(xì)胞分泌的糖蛋白，起保護(hù)結(jié)腸黏膜的作用;它由寡糖通過(guò)O-糖苷鍵與黏液蛋白骨架上的絲氨酸或蘇氨酸殘基結(jié)合而成的。黏蛋白在上皮細(xì)胞表面形成具有潤(rùn)滑作用并抵抗機(jī)械破壞及腸腔內(nèi)有害物質(zhì)侵襲的保護(hù)層。與胃、小腸的黏蛋白相比，結(jié)腸的黏蛋白硫酸化程度明顯增高，硫酸化后的黏蛋白能抵制腸腔內(nèi)細(xì)菌對(duì)黏液的酶解作用，從而更好地保護(hù)結(jié)腸黏膜，故在結(jié)腸中硫酸化后的黏蛋白更為重要，黏蛋白硫酸化程度的降低對(duì)結(jié)腸黏膜膠體層中的黏液是極其不利的［9］。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠結(jié)腸黏膜杯狀細(xì)胞數(shù)目減少、杯狀細(xì)胞中黏蛋白合成減少、黏液膠體層變薄、黏蛋白硫酸化的程度也降低，且黏蛋白減少量與局部炎癥程度有關(guān)，炎癥越嚴(yán)重，黏蛋白減少越明顯;予POP干預(yù)7 d后，杯狀細(xì)胞的數(shù)目及其黏蛋白分泌的表現(xiàn)均見(jiàn)明顯恢復(fù)。這表明POP可能通過(guò)刺激結(jié)腸黏蛋白的合成及分泌，促進(jìn)TNBs所致大鼠結(jié)腸炎損傷黏膜的修復(fù)和潰瘍愈合。

［1］Amit-Romach E，Reifen R，Uni Z.Mucosal function in rat jejunum and ileum is altered by induction of colitis［J］.Int J Mol Med.2006，18(4):721-727.

［2］張 濤，謝建群.大鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合消化雜志.2006，14(4):240-242.

［3］Morris G P，Beck P L，Herridge M S，et al.Hapten-induced model of chronic inflammation and ulceration in the rat colon［J］.Gastroenterology，1989，96(3):795-803.

［4］徐叔云，卞如濂，陳 修主編.藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，2002，1860-1861.

［5］王 皓，歐陽(yáng)欽，胡仁偉.三硝基苯磺酸結(jié)腸炎動(dòng)物模型的建立［J］.胃腸病學(xué)，2001，6(1):7-10.

［6］謝建群，張 濤，施斌等.清腸栓治療潰瘍性結(jié)腸炎的臨床和實(shí)驗(yàn)研究述評(píng)［J］.上海中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào).2008，22(1):70-72.

［7］盧新華，何軍山，朱湘忠.馬齒莧多糖對(duì)小鼠免疫功能影響的研究［J］.中藥藥理與臨床，2006，22(3):89-90.

［8］Sylvester PA，Wong NA，Myerscough N，et al.Mucin expression in the ileoanal reservoir reflects incomplete mucosal adaptation［J］.J Pathol.2002，197(1):28-36.

［9］Krimi RB，Kotelevets L，Dubuquoy L，et al.Resistin-like molecule beta regulates intestinal mucous secretion and curtails TNBS-induced colitis in mice［J］.Inflamm Bowel Dis，2008，14(7):931-41.