妊娠相關(guān)血漿蛋白A定量測(cè)定方法的建立*

李靈俊 陳淑蓮 李向東 彭學(xué)靜 李會(huì)強(qiáng) 王學(xué)謙

妊娠相關(guān)血漿蛋白A（pregnancy－associated plasma protein A，PAPP－A）是1974年由 Lin等首次從孕婦血清中分離出的一種來(lái)源于胎盤(pán)組織的糖蛋白，在外周血中以PAPP－A/proMBP異構(gòu)聚合體的形式存在[1]。PAPP-A是孕早期篩查唐氏綜合征的敏感指標(biāo)[2]，在心血管疾病的診斷和預(yù)后判斷方面也具有一定價(jià)值，研究顯示PAPP-A參與血管的修復(fù)過(guò)程及動(dòng)脈粥樣硬化損傷的進(jìn)展,并與斑塊的不穩(wěn)定性和破裂密切相關(guān)[3]。本文采用生物素化牛血清白蛋白-鏈霉親和素微孔板間接包被法[4]，將標(biāo)記有生物素的抗PAPP－A抗體作為捕獲抗體，結(jié)合抗原；標(biāo)記有辣根過(guò)氧化物酶的抗PAPP－A抗體作為檢測(cè)抗體，即形成微孔板－生物素化抗體－抗原－酶標(biāo)抗體的復(fù)合物，建立外周血PAPP-A定量酶聯(lián)免疫測(cè)定方法。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器 PAPP-A酶免測(cè)定試劑盒（美國(guó)DRG 公 司 ，EIA-2397，96T，LOT：46K128）； 單 克 隆 抗 體PAPP-A（10E1）0.5 g/L，PAPP－A（10E2）2．0 g/L，芬蘭 Hytest公司，4℃保存；96孔酶標(biāo)反應(yīng)板（美國(guó)Costar公司）；辣根過(guò)氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）、生物素（biotin，B）、鏈霉親和素（streptavidin，SA）、牛血清白蛋白（BSA）、四甲基聯(lián)苯胺 （3，3′，5，5′－tetramethylbenzidine，TMB） 均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，規(guī)格分別為 P8125－50 kU、B4639－1 mg、40945－1 mg、A7030－500 g、T4444－100 mL。血清標(biāo)本分別為 2009 年4—5月取自天津市王頂?shù)提t(yī)院的8～14周孕婦血清60份；2008年12月取自天津市中心婦產(chǎn)科醫(yī)院的孕晚期（≥37周）孕婦血清50份，分裝，－20℃凍存，孕周以末次月經(jīng)確定。酶標(biāo)分析儀（DNM－9602，北京普朗新技術(shù)有限公司）；洗板機(jī)（EL×50，美國(guó) BioTek Instruments公司）；自動(dòng)包被機(jī)（B2080905，北京楠華科技開(kāi)發(fā)有限公司、北京拓普分析儀器有限責(zé)任公司）。

1.2 方法

1.2.1 酶標(biāo)反應(yīng)板的制備 取生物素化牛血清白蛋白（BBC，濃度為 10 g/L），用包被緩沖液稀釋1∶3 000，每孔 150 μL，室溫過(guò)夜。棄除包被液，用BBC稀釋液洗滌2次，每孔150 μL，每次 10 min。加入鏈霉親和素，工作濃度為 1∶4 000，每孔150 μL，室溫2 h。棄除包被液，甩干，加入封閉緩沖液，每孔250 μL，室溫2 h。甩干備用。

1.2.2 生物素化抗體的制備 將待偶聯(lián)的抗PAPP-A抗體以適當(dāng)濃度溶解于0.1 mol/L碳酸氫鈉溶液（pH＝9．5）中充分透析，期間換液數(shù)次；將活化生物素以適當(dāng)濃度（通常為20 g/L）溶解于二甲基甲酰胺（DMF）中。將生物素緩慢、逐滴加到攪拌中的抗體溶液中，在室溫下攪拌1 h。在4℃下用0.1 mol/L，pH＝7．4 的磷酸鹽緩沖液（PBS）透析 24 h，其中換液數(shù)次，充分除去未結(jié)合的游離生物素，以1∶1的比例加入貯存液，分裝，4℃保存。通過(guò)實(shí)驗(yàn)測(cè)試工作濃度為1∶4 000。

1.2.3 酶標(biāo)抗體的制備 采用改良過(guò)碘酸鈉法標(biāo)記?？筆APP-A抗體于0.3 mol/L碳酸鹽緩沖液中冷藏透析過(guò)夜；取出透析后抗體加入已活化的HRP，避光，攪拌，反應(yīng)1 h。于平衡液（0.01 mol/L的PBS）中冷藏過(guò)夜透析酶結(jié)合物粗品。取出已透析酶結(jié)合物，上樣于已平衡好的Sephadex G-200凝膠柱，用平衡液洗脫，收集，即為純化的酶標(biāo)志物。用0.45 μm的濾膜過(guò)濾除菌，以1∶1的比例加入貯存液，分裝，4℃放置備用。經(jīng)實(shí)驗(yàn)測(cè)試工作濃度為1∶4 000。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)品的制備 孕晚期混合孕婦血清，以所購(gòu)試劑盒進(jìn)行測(cè)定，確定血清標(biāo)本濃度，使用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液配制系列標(biāo)準(zhǔn)品，濃度分別為 50、25、10、5、2.5、1 、0 mg/L。

1.2.5 操作步驟 血清標(biāo)本按1∶16稀釋?zhuān)锼鼗贵w及酶標(biāo)抗體最佳工作濃度均為1∶4 000。根據(jù)生物素-鏈霉親和素酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）放大檢測(cè)系統(tǒng)[5]結(jié)合本文，操作步驟如下：BBC微孔板內(nèi)加入10 μL標(biāo)準(zhǔn)品、待測(cè)樣品，同時(shí)加入100 μL生物素標(biāo)記抗PAPP-A抗體，37℃水浴反應(yīng)30 min后洗板甩干；每孔加入100 μL酶標(biāo)記抗PAPP-A抗體，37℃水浴反應(yīng)30 min；加入顯色液A、B各50 μL，避光，室溫反應(yīng)15 min，加入終止液50 μL，立即以630 nm作為參考波長(zhǎng)，測(cè)定450 nm處的吸光度（A450）。DRG試劑盒測(cè)定按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3 方法學(xué)鑒定實(shí)驗(yàn)

1.3.1 靈敏度 對(duì)0 mg/L標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行10次重復(fù)測(cè)定，計(jì)算其吸光度（A）值的均值（x）、標(biāo)準(zhǔn)差（s），用標(biāo)準(zhǔn)曲線反算出其x+2 s對(duì)應(yīng)的濃度值，即為本試劑盒的靈敏度。

1.3.2 準(zhǔn)確度 采用回收實(shí)驗(yàn)測(cè)定。向2份已知不同濃度標(biāo)準(zhǔn)血清中分別加入2份不同濃度的臨床血清標(biāo)本，測(cè)定其PAPP－A含量，計(jì)算回收率?；厥章剩剑y(cè)定值－原PAPP－A濃度）/加入PAPP－A濃度×100%。

1.3.3 穩(wěn)定性 將試劑盒放置37℃溫箱，分別于第0、3、5、7天取出，進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線變化觀察其穩(wěn)定性。

1.3.4 精密度 用3份正常人血清配制成低、中、高濃度質(zhì)控血清，每個(gè)質(zhì)控血清平行做10孔，在同一塊酶標(biāo)板中測(cè)定它們的濃度，測(cè)批內(nèi)變異；采用相同方法分別于不同酶標(biāo)板中測(cè)定它們的濃度，測(cè)批間差異，觀測(cè)其精密度。變異系數(shù)（CV）=s/x×100%。

1.3.5 特異性 配制1 mg/L PAPP-A標(biāo)準(zhǔn)品，測(cè)定其A值，作為對(duì)照。同樣，于標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液中分別加入絨毛膜促性腺激素（β-HCG）、泌乳素（PRL）、甲胎蛋白（AFP）、雌二醇（E2）等，觀察各物質(zhì)達(dá)到同樣A值的加入量，計(jì)算交叉反應(yīng)率（交叉反應(yīng)率=各物質(zhì)加入量/PAPP-A量×100%）。

1.3.6 2種方法測(cè)定結(jié)果的比較 分別采用本文所建立方法和美國(guó)DRG公司試劑盒對(duì)30份早孕血清進(jìn)行檢查，采用相關(guān)性分析對(duì)2種檢測(cè)方法的測(cè)定結(jié)果進(jìn)行比較，以觀察這2種方法是否有差異，若2種方法無(wú)差異，說(shuō)明相關(guān)性較好。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行直線相關(guān)性分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 測(cè)定方法的靈敏度 同時(shí)測(cè)定10次0 mg/L標(biāo)準(zhǔn)品，用標(biāo)準(zhǔn)曲線反算出其A值的x±2 s對(duì)應(yīng)的濃度值，得出該方法的靈敏度為0.31 mg/L。

2.2 準(zhǔn)確度 回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果示其回收率均在95%以上，說(shuō)明此方法具有很好的準(zhǔn)確性，見(jiàn)表1。

表1 不同濃度標(biāo)本的回收率

2.3 穩(wěn)定性 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)顯示，在37℃溫箱中放置3 d與0 d無(wú)明顯變化，5 d后標(biāo)準(zhǔn)品A值均有所下降，但線性良好，不影響測(cè)定，說(shuō)明試劑盒的穩(wěn)定性良好。放置7 d后，最大A值較低，且線性較差，見(jiàn)圖1。

圖1 試劑盒穩(wěn)定性

2.4 精密度 低濃度檢測(cè)結(jié)果的CV不大于10%，高濃度和中濃度檢測(cè)結(jié)果的CV在10%左右，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)方法具有良好的重復(fù)性，見(jiàn)表2。

表2 不同濃度血清的批內(nèi)與批間變異

2.5 特異性 用本方法檢測(cè) β-HCG、PRL、AFP、E2達(dá)到1 mg/L的PAPP-A相同A值所需加入量及交叉反應(yīng)率，見(jiàn)表3。

表3 試劑盒交叉反應(yīng)率

2.6 2種方法測(cè)定結(jié)果的比較 2種方法測(cè)定30份標(biāo)本，以美國(guó)DRG公司試劑盒所測(cè)得PAPP-A濃度為X軸，本文方法測(cè)定濃度為Y軸，繪制散點(diǎn)圖，見(jiàn)圖2。對(duì)2個(gè)變量進(jìn)行相關(guān)性分析，r=0.982（P ＜0．01）；回歸方程為：Y贊＝2．286 1＋1．026 9 X。本文方法與美國(guó)DRG公司試劑盒方法高度相關(guān)，該方法可用于人外周血PAPP-A含量的測(cè)定。

圖2 DRG公司試劑盒所測(cè)結(jié)果與本文方法測(cè)定結(jié)果相關(guān)散點(diǎn)圖

3 討論

PAPP-A是從孕婦血清中分離出來(lái)的大分子糖蛋白，作為孕早期篩查唐氏綜合征的一種單項(xiàng)血清標(biāo)志物，其測(cè)定具有特別重要的意義[6]。目前國(guó)內(nèi)用于定量測(cè)定人體外周血PAPP-A含量的國(guó)產(chǎn)試劑盒較少，主要依賴(lài)國(guó)外進(jìn)口。測(cè)定方法有金標(biāo)法、ELISA、時(shí)間分辨、化學(xué)發(fā)光等。金標(biāo)法屬定量或半定量的方法，靈敏度、特異性較后三者低，后兩者準(zhǔn)確性及特異性較高，但速度慢，且設(shè)備昂貴，成本相對(duì)較高，不易在基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)推廣使用[7]。直接包被微孔板ELISA法雖操作簡(jiǎn)單、成本低廉，特異性較強(qiáng)，但仍需進(jìn)一步提高其靈敏度。而本文采用生物素化牛血清白蛋白-鏈霉親和素間接包被微孔板，牛血清白蛋白來(lái)源方便包被方式簡(jiǎn)單；親和素可預(yù)包被在微孔板內(nèi)，然后再將生物素化抗體包被于孔內(nèi)，從而解決了一些抗體不易包被的難題。有研究表明，通過(guò)這種間接包被模式可最大限度減少包被抗體的空間位阻效應(yīng)，提高抗體的利用效率，減少其用量，降低實(shí)驗(yàn)成本[8]。同時(shí)，這種包被模式具有較好的穩(wěn)定性，可延長(zhǎng)酶標(biāo)反應(yīng)板的效期，在此基礎(chǔ)上建立的人外周血PAPP-A含量ELISA測(cè)定法操作直接簡(jiǎn)便、費(fèi)用低廉，篩查范圍廣，靈敏度較高，值得推廣使用。

綜上，本文采用間接包被技術(shù)所建立的人外周血PAPP-A固相酶聯(lián)免疫測(cè)定方法靈敏、可靠、穩(wěn)定性好，與國(guó)外同類(lèi)試劑的測(cè)定結(jié)果之間相關(guān)性較高,可望替代同類(lèi)進(jìn)口試劑盒進(jìn)行PAPP-A含量測(cè)定、聯(lián)合β-HCG檢測(cè)及超聲胎兒頸半透明度測(cè)量用于孕早期唐氏綜合征的篩查。同時(shí)，作為易損斑塊有價(jià)值的標(biāo)志物，測(cè)定PAPP-A可望對(duì)急性冠脈綜合征患者的危險(xiǎn)度分層提供有效的幫助。

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