CD20單抗對(duì) Burkitt淋巴瘤細(xì)胞 Bcl-2和 p38MAPK蛋白表達(dá)的影響

秦文嬌,顧靜文,許小平,陳 潔,陳波斌,林果為

淋巴瘤是血液系統(tǒng)常見的腫瘤之一。靶向治療藥物聯(lián)合細(xì)胞毒藥物是目前淋巴瘤治療的熱點(diǎn)。其中 CD20單抗 (Mebthera,Rituximab,利妥昔單抗,美羅華)已經(jīng)在臨床有較多應(yīng)用[1],它通過多種作用方式誘導(dǎo)淋巴瘤細(xì)胞凋亡,如抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用 (ADCC)和補(bǔ)體依賴的細(xì)胞溶解作用 (CDC)。有文獻(xiàn)推測(cè) CD20單抗也可能直接誘導(dǎo) B淋巴細(xì)胞凋亡,但具體機(jī)制目前尚不清楚。Bcl-2基因 (B-cell lymphoma/Leukemia gene,B細(xì)胞淋巴瘤/白血病 -2基因)是凋亡因子的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的調(diào)節(jié)點(diǎn),其表達(dá)產(chǎn)物可抑制 B淋巴細(xì)胞凋亡的發(fā)生。80%低度惡性和 30%中度惡性淋巴瘤 Bcl-2基因有 t(14∶18)染色體移位,從而導(dǎo)致 Bcl-2蛋白的過表達(dá)。Bcl-2過表達(dá)的淋巴細(xì)胞是日后復(fù)發(fā)的根源,而且可導(dǎo)致對(duì)多種化療藥物的耐藥。臨床研究顯示抗 Bcl-2藥物可以增加 CD20單抗的療效,兩種藥物有協(xié)同作用。CD20單抗的應(yīng)用,是否也會(huì)影響 Bcl-2蛋白通路的表達(dá),從而引起細(xì)胞凋亡的改變,目前尚未有詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)室研究的報(bào)道。CD20有多個(gè)磷酸化位點(diǎn),包括細(xì)胞內(nèi)主要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)之一——絲裂素活化的蛋白激酶 (mitogen-activated protein kinases,MAPK)。p38 MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可在許多腫瘤細(xì)胞凋亡中發(fā)揮作用,其活性增加可保護(hù) B淋巴細(xì)胞免于凋亡。但是這一通路是否受 CD20單抗的調(diào)節(jié),目前亦尚無文獻(xiàn)報(bào)道。因此,本研究通過觀察不同濃度 CD20單抗對(duì) B淋巴細(xì)增殖的影響及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 Raji和 Namalwa淋巴瘤細(xì)胞株均來自于中國科學(xué)院細(xì)胞庫。培養(yǎng)于 RPMI 1640培養(yǎng)基至對(duì)數(shù)生長期。

1.2 細(xì)胞活力測(cè)定 將 Raji和 Namalwa細(xì)胞株加入終濃度為12.5μmol/L、25.0μmol/L和 50.0μmol/L的 CD20單抗中,以 PBS作為空白對(duì)照藥物作用不同時(shí)間 (12、24、48、72 h);棄上清,加入 MTT 20 l培養(yǎng) 4 h;加二甲亞砜 100μl,于 490 nm波長處測(cè)定吸光度值,計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。細(xì)胞增殖抑制率 (%)=(1-CD20單抗組吸光度值/對(duì)照組吸光度值)×100%。

1.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡指標(biāo) Annexin V+和 PI-細(xì)胞為早期凋亡細(xì)胞,Annexin V+和 PI+細(xì)胞為晚期凋亡細(xì)胞。將 50.0 μmol/L CD20單抗加入實(shí)驗(yàn)組,以空白 PBS為對(duì)照組。獲取細(xì)胞懸液,離心,PBS清洗 3次;加入 AnnexinⅤ -FITC及碘化丙啶 (PI)混勻反應(yīng)后用流式細(xì)胞儀檢測(cè),雙標(biāo)記法采集紅色熒光和綠色熒光,CELLQUEST軟件分析,以散點(diǎn)圖 (dot plot)形式打印。

1.4 目的蛋白的免疫印跡鑒定 吸棄細(xì)胞培養(yǎng)上清,PBS洗滌后加入 200μl的 M-PERTM試劑,將細(xì)胞裂解液離心,吸取清亮上清液 (細(xì)胞蛋白質(zhì))50.0μg/ml進(jìn)行 SDS-PAGE,電轉(zhuǎn)移 1.5 h分離后電轉(zhuǎn)移至 NC膜,密封置搖床 1 h,放入用封閉液稀釋的鼠抗人 Bcl-2、p38單克隆抗體液 (終濃度20μg/ml)孵育 1 h,TTBS緩沖液洗膜,移入羊抗鼠 IgG-HRP二抗中孵育;洗膜后 DAB顯色系統(tǒng)檢測(cè)。以 β-actin作為內(nèi)參,目的蛋白含量 =目的蛋白灰度值/同一樣本 β-actin灰度值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)以 (x±s)表示,兩組間數(shù)據(jù)比較用t檢驗(yàn),統(tǒng)計(jì)分析在 SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件上完成,P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CD20單抗對(duì)淋巴瘤細(xì)胞增殖的影響 不同終濃度的CD20單抗分別作用于 Raji細(xì)胞 12、24、48和 72 h后的細(xì)胞抑制率:12.5μmol/L時(shí)分別為 (5.80±0.29)%、(16.28±0.78)%、 (20.05±1.42)%和 (19.41±0.71)%;25.0 μmol/L時(shí)分別為 (19.06±0.75)%、 (30.39±0.26)%、(40.40±0.99)%和 (39.34±1.20)%;50.0μmol/L時(shí)分別為 (38.50±1.70)%、 (52.31±1.62)%、 (71.91±2.05)%和 (50.42±2.16)%。對(duì)同一終濃度、不同處理時(shí)間及相同處理時(shí)間、不同終濃度的細(xì)胞增殖抑制率進(jìn)行每兩組間統(tǒng)計(jì)分析,表明:不同終濃度的 CD20單抗作用 12、24和 48 h時(shí)細(xì)胞增殖抑制率間差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05,見圖 1)。同樣不同終濃度的 CD20單抗對(duì) Namalwa細(xì)胞也有相似的抑制結(jié)果。

2.2 CD20單抗誘導(dǎo)淋巴瘤細(xì)胞株凋亡 Raji細(xì)胞株實(shí)驗(yàn)結(jié)果:實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率為 (31.52±2.48)%,對(duì)照組為(2.03±0.94)%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05,見圖 2)。Namalwa細(xì)胞株實(shí)驗(yàn)結(jié)果:實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率為 (21.84±1.69)%,對(duì)照組為 (1.49±0.87)%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05,見圖 3)。

2.3 目的蛋白的檢測(cè)結(jié)果 使用50.0μmol/L的 CD20單抗處理 48 h后,2株細(xì)胞株中的 Bcl-2和 p38MAPK蛋白的表達(dá)量與對(duì)照組的表達(dá)量比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05,見表 1、圖 4)。

圖 1 CD20單抗對(duì)細(xì)胞增殖抑制率的影響Figure 1 The growth rate after Rituximab treatment

圖 2 Raji細(xì)胞凋亡率Figur e 2 The apoptosis rate of Raji cell

圖 3 Namalwa細(xì)胞凋亡率Figure 3 The apoptosis rate of Namalwa cell

表 1 CD20單抗對(duì) Bcl-2和 p38MAPK蛋白表達(dá)的影響 (x±s)Table 1 The effect of Rituximab on Bcl-2 and p 38MAPK protein expression of Raji and Namalwa lymphoma cell

圖 4 CD20單抗對(duì) Bcl-2和p 38MAPK蛋白表達(dá)的影響Figur e 4 The effect of Rituximab on Bcl-2and p 38MAPK protein expression of Raji and Namalwa lymphoma cell by Western blot

3 討論

淋巴瘤的靶向治療因其特異性殺傷靶細(xì)胞、不損傷正常組織細(xì)胞的特點(diǎn),臨床應(yīng)用日益廣泛。CD20單抗是其代表藥物,可通過 ADCC和 CDC誘導(dǎo) B淋巴瘤細(xì)胞凋亡,其誘導(dǎo) CD20陽性的 B淋巴瘤細(xì)胞直接凋亡的作用及機(jī)制越來越受到關(guān)注。

為了明確 CD20單抗抑制淋巴瘤細(xì)胞增殖的效果,選擇最佳的藥物作用濃度,本實(shí)驗(yàn)使用不同濃度 CD20單抗分別處理Raji細(xì)胞株 12、24、48和 72 h后測(cè)定細(xì)胞抑制率。結(jié)果顯示與對(duì)照組相比,實(shí)驗(yàn)組 Raji細(xì)胞株的細(xì)胞抑制率明顯增加,以 50.0μmol/L濃度處理 48 h后的效果最佳,可達(dá)到 (71.91±2.05)%?？梢娫谝欢ǚ秶鷥?nèi) CD20單抗對(duì) Raji細(xì)胞的增殖有明顯的抑制作用,且呈劑量 -效應(yīng)和時(shí)間 -效應(yīng)依賴關(guān)系。

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) 50μmol/LCD20單抗處理 48 h的 Raji和Nawalma細(xì)胞的凋亡率,實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞比對(duì)照組明顯增多,確切證實(shí)體外單獨(dú)使用 CD20單抗,未通過抗體和補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用,仍可以直接誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡,這是 CD20單抗殺傷淋巴瘤細(xì)胞的又一效應(yīng)機(jī)制。

用 Western blot檢測(cè) Raji和 Namalwa細(xì)胞株 Bcl-2和p38MAPK蛋白的表達(dá),結(jié)果表明:在 CD20單抗處理后的 Raji和 Namalwa細(xì)胞株中,Bcl-2和 p38MAPK蛋白的表達(dá)量與對(duì)照組相比均有明顯下降。

Bcl-2基因是一種原癌基因,具有抑制凋亡的作用,可以調(diào)節(jié)各種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的共同交叉點(diǎn)。Bcl-2過度表達(dá)可增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)大多數(shù) DNA損傷因子的抵抗性,抑制大多數(shù)化療藥物所引起的靶細(xì)胞凋亡[2]。p38MAPK在體內(nèi)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起協(xié)調(diào)作用,參與 B淋巴細(xì)胞凋亡的調(diào)控,有文獻(xiàn)認(rèn)為p38MAPK激活后對(duì) B淋巴細(xì)胞有保護(hù)作用,可以拮抗細(xì)胞毒藥物[3-4]。本研究前一步已證實(shí) CD20單抗可以直接誘導(dǎo)CD20(+)的 B淋巴瘤細(xì)胞的凋亡,因此結(jié)合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果推測(cè)其正是通過減少 Bcl-2及 p38MAPK蛋白的表達(dá),阻止了這兩個(gè)蛋白調(diào)控的抗凋亡通路的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡。結(jié)合臨床資料[5],抑制 Bcl-2的表達(dá)的藥物可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,增強(qiáng) CD20單抗的作用,與其有協(xié)同作用,也說明 Bcl-2蛋白表達(dá)減少可能是 CD20單抗發(fā)揮作用的途徑之一。

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