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    心理應激對實驗性2型糖尿病傾向大鼠下丘腦室旁核c-fosmRNA和CRFmRNA表達的實驗研究*

    2010-07-14 01:56:48劉艷民李慶和李慧吉
    天津中醫(yī)藥大學學報 2010年3期
    關鍵詞:心身下丘腦切片

    劉艷民,李 杰,李慶和,李慧吉,韓 娟

    010000 內蒙古師范大學(李 杰)

    300193 天津中醫(yī)藥大學(李慧吉,韓 娟)

    近年來,用心理應激源為刺激,以即刻早期基因(IEG)中的c-fosmRNA的表達作為基因細胞代謝活動標志,對心理應激的腦機制開展了大量的研究。心理應激作用與大腦改變腦的內分泌機能,其中最重要的途徑是下丘腦—垂體—腎上腺軸(HPA)被激活,下丘腦室旁核部位的c-fos表達可能作為第三信使調節(jié)CRF表達,進而控制ACTH的分泌,啟動HPA軸,影響與應激有關的行為、神經(jīng)內分泌免疫活動。研究證明應激可通過植物神經(jīng)系統(tǒng)和中樞神經(jīng)內分泌系統(tǒng)兩條途徑影響胰島素抵抗和β細胞功能,進而影響2型糖尿病發(fā)生。然而中樞神經(jīng)內分泌系統(tǒng)如何影響糖尿病發(fā)生的通路還未完全明了。根據(jù)前期實驗中血糖變化,我們推測心理應激引起2型糖尿病病生理改變的機制可能與激活大腦IEG表達相關。本實驗采用原位雜交技術,觀察心理應激對下丘腦室旁核即刻早期基因(cfos)mRNA和CRFmRNA表達的影響,同時觀察了心身5號對其表達的干預作用。

    1 材料與方法

    1.1 實驗動物 健康雄性Wister大鼠120只,體質量120~150g。由軍事醫(yī)學科學院第四研究所提供。適應性飼養(yǎng)1周。動物室內自然光照。室溫保持24℃,通風良好。飼以全價營養(yǎng)料,自由進食飲水,除實驗應激外無其他不良刺激。

    1.2 實驗動物模型及分組

    1.2.1 實驗性糖尿病動物模型 120只大鼠隨機分為兩組,一組為40只,另一組為80只。80只大鼠腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ,美國Sigma公司產品,溶解在0.1 mol/L檸檬酸緩沖液內,pH為4.0),30 mg/kg,1次/d,連續(xù)2 d(參考《現(xiàn)代藥理實驗方法與技術》)。余40只大鼠注射等量檸檬酸緩沖液,1次/d,連續(xù)2 d。注射30日后測查大鼠空腹血糖,以9.3 mmol/L為標準(參考《現(xiàn)代藥理實驗方法與技術》),篩除高血糖鼠,再隨機選取45只STZ鼠和20只正常鼠進入應激造模實驗。

    1.2.2 動物分組 全部動物共分為5組,其中45只STZ大鼠隨機分為3組,即單純STZ組(無應激)、STZ+應激組、中藥組(STZ+應激),15只/組。20只正常大鼠分為應激組和正常組,10只/組。

    1.2.3 動物模型實驗方法 參照Carter等[1]、姚樹橋等[2]方法,改良后建立本實驗應激方法。

    1)限制:將大鼠放入20 cm×5 cm×5 cm塑料筒中,水平置于實驗臺,保證大鼠不受壓。以不能回轉身為度,但其運動受限制,光線晦暗,限制刺激每周隨機擇時進行3次,每次45 min。2)旋轉:利用舊式唱機改裝為旋轉器,轉速為45 r/min,在此轉速下離心力最小,避免離心力過大傷害大鼠。旋轉時將大鼠置于代謝籠中。旋轉刺激每45~150 min內擇時進行1次,每次15~20 min。旋轉刺激隔日進行1次。3)擁擠:標準大鼠飼養(yǎng)籠,按應激組15只/籠,非應激組5只/籠喂養(yǎng)。刺激貫穿于實驗全過程,持續(xù)6周。

    2 中藥制備和給藥方法

    心身5號由旋覆花、代赭石、陳皮、茯苓、半夏、竹茹、丹參、赤芍、降香、烏藥、栝樓、遠志、炙枇杷葉、合歡皮、知母、蒼術、龍齒、黃芩組成,自動煎煮機煎煮,濃縮后置于-20℃冰箱貯藏備用。中藥組大鼠灌胃2 mL/次(其生藥濃度為960g/L),2次/d至實驗結束,余組大鼠給予等量生理鹽水灌胃,2次/d。

    3 實驗指標測定

    3.1 下丘腦即刻早期基因c-fosmRNA表達測定 主要試劑:c-fosmRNA原位雜交檢測試劑盒(天津TBD生物技術發(fā)展中心提供)。實驗操作步驟:常規(guī)脫水,浸蠟,包埋。切片厚度為5 um,置于預先用多聚賴氨酸處理過的載玻片上。石蠟切片經(jīng)常規(guī)脫蠟至水。3%雙氧水(H2O2)室溫處理10 min,滅活內源性過氧化酶。切片上滴加3%檸檬酸新鮮稀釋的復合消化液(1 mL 3%檸檬酸加入2滴濃縮型復合消化液,混勻),37℃消化5~20 min。暴露目的基因mRNA核酸片段。0.5 mol PBS洗3次×5 min。蒸餾水洗1次。雜交盒中加入5~10 mL蒸餾水。每張切片加20 uL含CRF寡聚核苷酸探針雜交液。將原位雜交專用蓋玻片的保護膜揭開后,蓋在玻片上。恒溫箱37℃雜交30~120 min。雜交后揭去蓋玻片。30~37℃左右水溫的2×SSC洗滌5min×3次。

    每張切片取2 uL雜交探針穩(wěn)定液A和18 uL雜交探針穩(wěn)定液B,混勻,加在切片上,濕盒中37~40℃反應20 min。2×SSC洗滌5 min×3次。滴加封閉液,37℃20 min。甩去多余液體,不洗。滴加兔抗地高辛,37℃60 min。0.5 mol PBS洗2 min×3次。滴加生物素化羊抗兔IgG,37℃20 min。0.5 mol PBS洗2 min×3次。滴加 SABC,37℃ 20 min。0.5 mol PBS洗2 min×4次。DAB顯色:使用DAB顯色試劑盒1 mL蒸餾水加顯色劑A、B、C各1滴,混勻,加在標本上。顯色20~30 min。蘇木素復染,充分水洗。乙醇脫水,二甲苯透明,封片。

    4 下丘腦促腎上腺皮質激素釋放因子(CRF)mRNA表達測定

    主要試劑、實驗試劑配置、實驗步驟同上。

    5 統(tǒng)計分析

    采用HPIAS-1000高清晰度彩色病理圖像分析系統(tǒng)(由武漢同濟醫(yī)科大學千屏影像工程公司提供),對各組動物下丘腦室旁核切片進行定量分析。隨機選取各組下丘腦室旁核6~7視域,于400倍高倍鏡下,以0.2073 um像素點長,在1.219×103um2測量窗下,測取棕色反應物的面數(shù)密度、總數(shù)目、總面積、平均灰度值,分析下丘腦室旁核內c-fosmRNA和CRFmRNA表達的相對水平。測量數(shù)據(jù)采用方差分析進行統(tǒng)計。

    6 實驗結果

    6.1 各組實驗大鼠下丘腦室旁核c-fosmRNA表達量比較 見表1。

    表1 各組大鼠下丘腦室旁核c-fosmRNA表達比較(±s)

    表1 各組大鼠下丘腦室旁核c-fosmRNA表達比較(±s)

    注:與正常組相比 ★★P<0.01,與應激組相比◆P<0.05,◆◆P<0.01;與單純 STZ 組相比 ▲▲P<0.01,與 STZ+應激組相比☆P<0.05,☆☆P<0.01。

    組別正常組應激組單純STZ組STZ+應激組中藥組n 10 10 12 15 14總面積52.17±17.42 281.69±96.89★★219.59±65.02 391.48±71.69▲▲◆303.44±27.72☆總數(shù)目1.17±0.408 6.50±1.871★★2.83±0.408 11.83±3.971▲▲◆◆5.50±1.225☆☆面數(shù)密度9.57±3.35 47.69±16.13★★23.24±3.37 89.07±32.58▲▲◆45.12±10.05☆☆

    6.2 各組實驗大鼠下丘腦室旁核CRFmRNA表達量比較 見表2。

    表2 各組大鼠下丘腦室旁核CRFmRNA表達比較(±s)

    表2 各組大鼠下丘腦室旁核CRFmRNA表達比較(±s)

    注:與正常組相比★★P<0.01,與單純STZ組相比▲▲P<0.01;與應激組相比◆P<0.05,與 STZ+應激組相比☆P<0.05,☆☆P<0.01。

    組別正常組應激組單純STZ組STZ+應激組中藥組n 10 10 12 15 14總面積37.84±9.58 219.22±86.58★★138.79±33.72 300.57±176.46▲▲181.99±62.08☆總數(shù)目1.33±0.516 5.61±1.966★★2.33±0.516 8.67±2.658▲▲◆3.83±0.753☆☆面數(shù)密度9.57±3.35 54.69±16.13★★19.14±4.23 71.07±21.79▲▲◆31.43±6.17☆☆

    7 討論

    研究證實,應激誘導的c-fos表達多見于室旁核背、腹側富含CRF和ACTH神經(jīng)元的小細胞區(qū)[3]。Imaki等[4]用c-fosmRNA探針研究PVA在束縛應激后c-fosmRNA水平變化的時程關系,c-fosmRNA及CRFmRNA水平變化的時程關系,c-fosmRNA的最高水平在應激開始后120~180 min,且c-fosmRNA和CRFmRNA的表達是同步增加的。根據(jù)這些研究資料,有人推測CRFmRNA就是c-fos的下游靶基因[5],當心理應激發(fā)生時,下丘腦首先被激活,在PVN有c-fos和c-jun mRNA轉錄,繼而表達FOS和JUN蛋白,F(xiàn)OS與JUN蛋白形成二聚體,作為第三信使與CRFmRNA啟動子上AP-1位點結合,激活CRFmRNA,使下丘腦PVN小細胞分泌神經(jīng)元分泌CRF,啟動HPA軸。

    本實驗研究中發(fā)現(xiàn),應激刺激可引起正常大鼠下丘腦室旁核c-fosmRNA轉錄活動增強,下丘腦室旁核CRFmRNA表達同步增加,尤其STZ+應激組大鼠各項指標的含量增加更顯著,推測可能是應激導致下丘腦PVN中c-fosmRNA表達及FOS蛋白合成增多,結果引起其下游靶基因CRFmRNA表達增多,激活HPA軸所致。由于STZ大鼠存在心理和病理雙重應激作用,因而各項指標含量增加更明顯。因此我們認為不良心理應激誘發(fā)2型糖尿病大鼠發(fā)病可能與應激激活HPA軸中c-fosmRNA和CRFmRNA在細胞分子水平表達過多有關[4-5]。

    針對心身疾病共同的病機為氣機失調(主要以氣滯、氣逆為主)及由其所產生的瘀血、寒結、熱結或寒熱互結的基本病理變化,同時結合糖尿病自身的病機特點為陰虛燥熱,課題組提出理氣降逆,散結活血,滋陰清熱為糖尿病的基本治則,并擬定心身5號方藥。實驗結果表明心身5號具有干預心理應激引起HPA通路的激活的作用,間接證實心理應激誘發(fā)實驗性2型糖尿病基本病機氣機失調的客觀存在,應激激活HPA軸中c-fosmRNA和CRFm-RNA在細胞分子水平表達過多可能是其客觀實質。本實驗說明心身5號既可整體調整氣機,又對具體疾病有所專攻,是治療心身疾病糖尿病的有效臨床方劑。

    [1]Carter W R,Herman J,Stokes K.Promotion of diabetes onset by stress in BB rats[J].Diabetologia,1987,30:674-675.

    [2]蔡偉雄,姚樹橋,戴曉陽,等實驗性應激對STZ昆明小鼠血糖水平影響的對照研究[J].中國心理衛(wèi)生雜志,1999,13(5):287-289.

    [3]Sharp F R,Sagar SM,Hichs K,et al.C-fos mRNA,FOS.and FOS_related antigen induction by hypertonic saline and stress[J].J Neuroscience.1990,21:2321-2331.

    [4]Imaki T,Shibasaki T,Wang XQ,et al.Intracerebrovetricular administration of corticotropin-releasing factor antagonist attenuates c-fos mRNA expression in the paravetricular nuleus after stress[J].Neuroendocrind,1995,61:445-452.

    [5]Culloan WE.FOS expression in forebrain afferenta to the hypothalamic paravetricular nuleus following swim stress[J].J Comp Neurol.1996,368(1):88-99.

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