回神顆粒對急性腦梗死大鼠長時程增強的影響

龐 瑩，韓大東，楊 卓，陳寶貴

300071 南開大學(xué)醫(yī)學(xué)院（韓大東，楊 卓）

301700 天津市武清區(qū)中醫(yī)醫(yī)院（陳寶貴）

腦卒中是嚴(yán)重危害人類健康和生命安全的常見的難治性疾病，中醫(yī)學(xué)將其列為“風(fēng)、癆、臌、膈”4大疑難病之首，存在著明顯三高（發(fā)病率高、致殘率高、病死率高）現(xiàn)象。腦卒中又以缺血性中風(fēng)為多，急性腦缺血后常有相應(yīng)的運動、感覺、知覺以及學(xué)習(xí)記憶障礙，其中學(xué)習(xí)記憶障礙最為常見持久?；厣耦w粒是導(dǎo)師陳寶貴教授在長期臨床實踐中，在不斷總結(jié)用藥經(jīng)驗基礎(chǔ)上研制而成，是治療腦缺血的有效中藥復(fù)方制劑，具有良好的腦神經(jīng)細(xì)胞保護作用。在前期行為學(xué)實驗中，已經(jīng)證明回神顆粒可以提高大鼠智力，增強學(xué)習(xí)記憶能力[1]，本次研究擬進一步證實其提高大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的作用機制。

1973年，Bliss和他的同事在兔海馬中發(fā)現(xiàn)一種高頻刺激誘發(fā)的長達(dá)數(shù)小時的突觸傳遞增強，即長時程增強（LTP）[2]，LTP被認(rèn)為是神經(jīng)突觸傳遞和可塑性的一種表現(xiàn)形式[3]。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，海馬是與學(xué)習(xí)記憶、情緒和行為功能密切相關(guān)的重要腦區(qū)，其突觸可塑性和傳遞增強則與學(xué)習(xí)記憶功能密切相關(guān)，大量的研究證實LTP與記憶形成的分子機制有高度的一致性，LTP已被廣泛地認(rèn)為是研究記憶的最佳細(xì)胞模型[3]。本研究就從觀察大鼠海馬LTP的變化來闡述回神顆粒改善學(xué)習(xí)記憶能力的機制。

1 材料和方法

1.1 材料 PowerLab，澳大利亞ADInstruments公司；頭部立體定位儀，日本Narishige；回神顆粒，天津武清中醫(yī)醫(yī)院生產(chǎn)。

1.2 分組、建模與給藥 48只健康雄性Wistar大鼠，體質(zhì)量250～320g，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供。隨機分為模型組、對照組、藥物組，各組再分成1 d、3 d、7 d 3個亞組，每個亞組8只。

缺血模型大鼠參照Zea-Longa線拴法復(fù)制大腦中動脈缺血模型（MCAO）。大鼠用10%水合氯醛（0.9 mL/250g）腹腔注射麻醉，暴露出左側(cè)頸總動脈和分叉部，分離動脈分叉處的頸內(nèi)動脈和頸外動脈，將頸外動脈近心端結(jié)扎，將預(yù)先準(zhǔn)備好的直徑為0.235 mm、長約5 cm、前端加熱成圓形的漁線，用肝素浸泡后插入頸內(nèi)動脈，直至有阻力時，即阻斷大腦中動脈（MCA）入口處，清潔縫合傷口。

待大鼠清醒后按Zausinger六分法對其神經(jīng)功能進行評分。0分，不能自發(fā)行走；1分，自由走動狀態(tài)下向病變對側(cè)旋轉(zhuǎn)；2分，抓住鼠尾，大鼠向病變對側(cè)旋轉(zhuǎn)；3分，對于施向病變對側(cè)的側(cè)壓力抵抗力下降者；4分，不能伸直病變對側(cè)前爪，甚至全身向?qū)?cè)屈曲；5分，無神經(jīng)功能缺損。剔除5分者。

藥物組大鼠待建模結(jié)束、清醒、評分后，灌胃給藥，從建模第一天起連續(xù)每日給藥至測LTP，0.7g/（kg·d）。

1.3 電生理學(xué) 實驗大鼠予30%烏拉坦（1.2g/kg）麻醉，固定于頭部立體定位儀，檢測海馬內(nèi)嗅區(qū)前穿通纖維（PP）和海馬齒狀回（DG）之間長時程增強（LTP）。依據(jù)Paxinos和Watson大鼠腦立體定位圖譜（1986年），記錄LTP時，置于PP的刺激電極為前囟后7.8～8 mm，中線旁4～4.5 mm；置于DG的記錄電極位于前囟后3～3.8 mm，中線旁1.5～2.5 mm。用比較接近生理變化的theta頻率刺激（TBS）誘導(dǎo)出LTP。記錄電極和刺激電極均緩慢插入，直到選一固定強度并能記錄出最大群體峰電位（PS）的部位。檢測刺激為單個方波，波寬0.1 ms，選取能誘發(fā)最大PS幅度1/2～1/3的強度。記錄20 min低頻（0.1 Hz，波寬0.1 ms）誘導(dǎo)的反應(yīng)作為基礎(chǔ)值，再給予高頻刺激（6個5 Hz的串刺激，每個串刺激有5個頻率為100 Hz的單脈沖，TBS重復(fù)10次，每次間隔20 s）誘導(dǎo)LTP。記錄并保存刺激前20 min至刺激后2 h的反應(yīng)，分析興奮性突觸后電位（EPSP）的斜率和PS的幅值。

1.4 數(shù)據(jù)分析 排除沒有引出波形大鼠和過高或過低數(shù)值，每組有5只大鼠進入數(shù)據(jù)分析。實驗結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間差異采用方差分析。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)功能評分 大鼠建模清醒后進行第一次評分，之后隨機入組，經(jīng)統(tǒng)計各組大鼠評分差異無統(tǒng)計學(xué)意義，具有可比性見表1。之后每天給藥前予以評分，各組大鼠在測LTP之前進行最后一次評分，模型組評分均有所下降，藥物3 d組和藥物7 d組評分增高，經(jīng)統(tǒng)計藥物7 d組與模型7 d組的差異有統(tǒng)計學(xué)意義，見表2。

表1 各組大鼠建模后第一次神經(jīng)功能評分比較（±s）

表1 各組大鼠建模后第一次神經(jīng)功能評分比較（±s）

組別模型組藥物組n55 1 d 1.875±0.8345 1.500±0.5477 3 d 2.000 0±0.500 0 1.833 3±0.752 8 7 d 1.833 3±0.408 2 2.000 0±0.707 1

表2 各組大鼠LTP前最后一次神經(jīng)功能評分比較（±s）

表2 各組大鼠LTP前最后一次神經(jīng)功能評分比較（±s）

注：①與模型7d組比較，P<0.05。

組別模型組藥物組n55 1 d 1.750 0±0.707 1 1.666 7±0.516 4 3 d 1.888 9±0.333 3 2.333 3±0.816 5 7 d 1.666 7±0.516 4 2.400 0±0.547 7①

2.2 LTP

2.2.1 興奮性突觸后電位（EPSP）的斜率 各組大鼠均能誘導(dǎo)出LTP，各個亞組中對照組與模型組的EPSP斜率的差異都有統(tǒng)計學(xué)意義（1 d組P<0.05，3 d組與7 d組P<0.01）。1 d組中，藥物組的EPSP斜率高于模型組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見圖1。隨著治療時間的延長，藥物組EPSP斜率呈現(xiàn)增高趨勢，7 d時明顯高于1 d；而模型組基本無變化；兩組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（3 d組P<0.05，7 d組P<0.01；見圖 2、圖 3）。

圖1 1d組高頻刺激（HFS）后EPSP斜率的比較

圖2 3d組高頻刺激（HFS）后EPSP斜率的比較

圖3 7d組高頻刺激（HFS）后EPSP斜率的比較

2.2.2 PS幅值 模型組與對照組的PS幅值相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（1 d、3 d、7 d組均為 P<0.01）。隨著天數(shù)的增加，模型組與藥物組的PS幅值均有所增高，但藥物組增幅高于模型組（1 d組P<0.05，3 d組與7 d組P<0.01）。（如圖4、圖5、圖 6所示）

3 討論

圖4 1d組高頻刺激（HFS）后PS幅值的比較

圖5 3d組高頻刺激（HFS）后PS幅值的比較

圖6 7d組高頻刺激（HFS）后PS幅值的比較

急性腦卒中時神經(jīng)系統(tǒng)的一些連接被破壞，其恢復(fù)是一個重新建立信號連接的過程。為調(diào)節(jié)各種適應(yīng)性反應(yīng)，神經(jīng)系統(tǒng)的回路在整個生活過程中都是可變、修飾或稱為可塑的，它可影響神經(jīng)系統(tǒng)的生長發(fā)育、神經(jīng)的損傷和修復(fù)及學(xué)習(xí)記憶多種腦功能，而突觸連接變化是學(xué)習(xí)記憶的神經(jīng)基礎(chǔ)[4]。腦的可塑性包括所有神經(jīng)功能重組的可能機制：復(fù)原功能上相同而未損通路，突觸發(fā)生，樹突發(fā)芽，強化現(xiàn)有的但功能沉默的突觸連接，促進梗死區(qū)周圍LTP，生存的神經(jīng)細(xì)胞的纖維發(fā)芽等。LTP現(xiàn)象被認(rèn)為反映了突觸水平的記憶過程,一些損害學(xué)習(xí)記憶的因素可減低或阻斷LTP的形成,而易化LTP的因素或藥物能提高動物的學(xué)習(xí)記憶能力[5]。LTP的形成機制十分復(fù)雜，其中心環(huán)節(jié)是細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高以及由此引發(fā)的下游生化事件，如蛋白激酶活化、N-甲基-D天門冬氨酸受體 (興奮性神經(jīng)遞質(zhì)受體)表達(dá)增多等[6]。Sopala等[7]研究表明短暫的大腦中動脈閉塞導(dǎo)致病灶同側(cè)的海馬腦片誘導(dǎo)LTP的僵直刺激只產(chǎn)生短暫的增強，在1h內(nèi)恢復(fù)到僵直前水平，表明短暫的大腦中動脈閉塞導(dǎo)致病灶同側(cè)的海馬功能障礙。

回神顆粒由人參、石菖蒲、鹿角、靈芝、丹參、五味子、川芎等藥物組成，在治療創(chuàng)傷性腦損傷、腦梗死[8]、腦出血[9]、各種癡呆等[10]神經(jīng)疾病方面都取得了良好的療效。本文記錄了通過灌服回神顆粒治療的急性腦梗死大鼠內(nèi)嗅區(qū)前穿通纖維-海馬齒狀回（PP-DG）的LTP，PS幅值和EPSP斜率增大都反映了突觸后細(xì)胞同步活動的增強，這些電生理指標(biāo)的改變必然會影響突觸后神經(jīng)元的動作電位的產(chǎn)生，影響學(xué)習(xí)記憶等高級神經(jīng)反射活動。結(jié)合同時期的大鼠神經(jīng)功能評分，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大鼠PP-DG的LTP效應(yīng)強度與大鼠神經(jīng)功能評分的改善是平行的。

筆者的研究表明，回神顆粒能改善大鼠腦缺血后神經(jīng)功能的缺損，糾正由永久性大腦中動脈閉塞引起的缺血同側(cè)海馬DG區(qū)基本的突觸傳遞降低和單脈沖刺激海馬穿通纖維引起的齒狀回顆粒細(xì)胞的共同發(fā)放幅度的降低，消除缺血對缺血同側(cè)海馬DG區(qū)突觸傳遞造成的損害，可以提高由于缺血造成的海馬DG區(qū)LTP的幅度，并能提高其斜率。筆者認(rèn)為，回神顆粒通過提高缺血后突觸傳遞的效率來促進腦缺血后突觸可塑性的形成，進而影響腦缺血后大腦功能的重組。

突觸可塑性依賴于不同突觸前、突觸后神經(jīng)元機制和突觸周圍的膠質(zhì)細(xì)胞[11]，本實驗研究雖然提示回神顆粒影響了LTP誘導(dǎo)和維持，但尚不能揭示其影響LTP的機制，這是值得進一步研究的課題。

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