APRIL在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)研究①

孫寶蘭 朱 俐 王 行 倪紅兵 王惠民 (南通大學(xué)附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心,南通 226001)

肺癌高發(fā)病率、高死亡率,是嚴(yán)重威脅人類健康和生命的惡性腫瘤之一[1],其中非小細(xì)胞肺癌(Nonsmall cell lung cancer,NSCLC)占全部肺癌的75%左右[2],在包括肺癌在內(nèi)的各種腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中,相對(duì)于基因突變而言基因表達(dá)異常更為普遍,研究在NSCLC中異常表達(dá)的腫瘤相關(guān)基因,評(píng)價(jià)其在肺癌發(fā)生發(fā)展中的作用是有效預(yù)防和診斷NSCLC的前提。

增殖誘導(dǎo)配體(A proliferation-inducing ligand,APRIL)屬于腫瘤壞死因子超家族,大量研究表明,APRIL與腫瘤生長(zhǎng)調(diào)節(jié)關(guān)系密切,在體內(nèi)、外均能刺激腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng),在多種腫瘤細(xì)胞株和腫瘤組織如結(jié)腸癌、腮腺癌及淋巴組織中都有高表達(dá)[3,4]。本文擬采用RTQ-PCR(Real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,RTQ-PCR)、 Western blot和免疫組化技術(shù)(IHC)檢測(cè)APRIL在NSCLC組織中的表達(dá)情況,探討APRIL在肺癌發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 NSCLC新鮮組織標(biāo)本取自2006年8月至2008年5月南通大學(xué)附屬醫(yī)院胸外科NSCLC手術(shù)病例68例,均經(jīng)病理學(xué)檢查確診,所有患者術(shù)前未行化療及放療,其中男44例,女24例,年齡35～72歲,平均62.6歲。按WHO“肺腫瘤組織學(xué)分型”(2000)標(biāo)準(zhǔn)分類,組織病理分型為鱗癌36例,腺癌32例。全部標(biāo)本于手術(shù)時(shí)收集,分裝后立即放入-70℃低溫冰箱凍存。肺癌組織取自原發(fā)癌灶,遠(yuǎn)端正常肺組織取自距癌灶邊緣7厘米以上的部位,并經(jīng)病理學(xué)檢查未見癌細(xì)胞。

NSCLC石蠟標(biāo)本取自南通大學(xué)附屬醫(yī)院病理科2007年1月至2008年3月間的NSCLC 50例,入選標(biāo)準(zhǔn):(1)術(shù)前未行放療、化療、免疫治療等抗腫瘤治療;(2)石蠟標(biāo)本完好,臨床原始資料完整。其中男性31例,女性19例,平均年齡61.5歲。每例均重新復(fù)習(xí)閱片。組織病理分型為鱗癌26例,腺癌24例。高分化 6例,中分化26例,低分化18例。TNM分期:Ⅰ期19例,Ⅱ期24例,Ⅲ期5例,Ⅳ期2例。伴肺門和/或縱隔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者33例。同時(shí)取遠(yuǎn)端正常組織10例作為對(duì)照。所有標(biāo)本均經(jīng)10%福爾馬林固定,常規(guī)脫水后石蠟包埋,病理診斷無(wú)異議。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RTQ-PCR)檢測(cè)APRIL mRNA表達(dá) 根據(jù)APRIL注冊(cè)號(hào)(AF046888)和內(nèi)參β2微球蛋白(β2microgluobulin,β2M)(注冊(cè)號(hào) NM 004048),采用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)相應(yīng)引物,引物序列如下:APRIL上游引物:5′-ACT CTC AGT TGC CCT CTG GTT G-3′(819 nt～840 nt),APRIL 下游引物 :5′-GGA ACT CTG CTC CGGGAGACT C-3′(984nt～1005 nt),擴(kuò)增 片段長(zhǎng)度 187 bp;β2M 上 游引物:5′-CTA TCC AGC GTA CTC CAA-3′(119 nt～ 136 nt),β2M下游引物:5′-GCA GGC ATA CTC ATC TTT T-3′(342 nt～360 nt),擴(kuò)增片段長(zhǎng)度242 bp,均由上海生物工程公司合成。取100 mg組織加1 ml Trizol(Invitrogen),按說(shuō)明書操作提取細(xì)胞總RNA,核酸蛋白分析儀(HITACHI公司)檢測(cè)RNA質(zhì)量和濃度;取總RNA 3.0 μ g,以O(shè)ligo(DT)18為引物,按試劑盒說(shuō)明書逆轉(zhuǎn)錄為 cDNA,分裝后-20℃保存。將 2 μ l cDNA模板加入18 μ l PCR反應(yīng)液(含 1×PCR buffer,4.0 mmol/L MgCl2,0.2 mmol/L dNTPs,APRIL或 β2M 上 、下游引物各0.15 μ mol/L,20×SYBR GreenⅠ0.3 μ l,Taq DNA聚合酶1.5 U?；靹蚝蠹尤隦oche專用毛細(xì)管中,并設(shè)空白對(duì)照、以空載質(zhì)粒作模板的陰性對(duì)照和相應(yīng)的6個(gè)質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品(濃度分別為106、105、104、103、102、10 copies/μ l)。各反應(yīng)管于 Roche 熒光定量檢測(cè)儀(Lightcycler)進(jìn)行PCR擴(kuò)增:94℃預(yù)變性3分鐘;94℃5秒,62℃35秒,共40個(gè)循環(huán)。根據(jù)各自標(biāo)準(zhǔn)品建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線,由軟件自動(dòng)計(jì)算待測(cè)樣本中APRIL或β2M準(zhǔn)確含量,以所測(cè)APRIL mRNA和β2M mRNA含量的比值作為評(píng)價(jià)APRIL表達(dá)水平的指標(biāo)。

1.2.2 Western blot檢測(cè)APRIL蛋白表達(dá) 稱取約100 mg組織標(biāo)本,用剪刀剪碎,加入1 ml含PMSF的裂解液(碧云天)混勻,于冰浴中用勻漿器充分勻漿,低溫(4℃)12 000 r/min離心15分鐘。吸取上清液與5×樣品緩沖液混合,100℃變性,離心,加入樣品孔中,蛋白上樣量為50 μ g。電泳(80 V,20分鐘;100 V,90分鐘),凝膠(300 mA,130分鐘)轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜。PVDF膜用1×TBS-T配制的5%的脫脂奶粉封閉,37℃震蕩1小時(shí),洗膜5 min×3次,加入1∶1 000濃縮型兔抗人APRIL多克隆抗體(美國(guó),芝加哥),4℃過夜,洗膜5分鐘×3次,加入二抗(1∶2 500)37℃孵育1小時(shí),洗膜5分鐘×3次,ECL試劑顯影。以β-actin作為內(nèi)參。

1.2.3 免疫組織化學(xué)法進(jìn)一步研究APRIL蛋白表達(dá)和定位 濃縮型兔抗人APRIL多克隆抗體(美國(guó) ,芝加哥),使用濃度 2 μ g/ml。即用型SP 法免疫組化檢測(cè)試劑盒(美國(guó)GBI公司),DAB顯色試劑盒(北京中山生物有限公司)。將入選的所有組織蠟塊每一個(gè)均連續(xù)切片2～3張、切片厚度5 μ m,其中 1張行HE染色,其余采用鏈霉素抗生素蛋白-過氧化酶連接(SP)免疫組化方法檢測(cè),用PBS代替一抗作陰性對(duì)照,檢測(cè)程序嚴(yán)格按產(chǎn)品說(shuō)明書進(jìn)行。光學(xué)顯微鏡下以細(xì)胞漿和/或細(xì)胞膜被染成淡黃至棕黃色者為陽(yáng)性細(xì)胞,評(píng)分根據(jù)Allred計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)[5],按照染色的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和染色強(qiáng)度評(píng)分。陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)分為6個(gè)級(jí)別:0.無(wú)細(xì)胞染色;1.＜1%的細(xì)胞染色;2.1%～10%的細(xì)胞染色;3.11%～33%的細(xì)胞染色;4.34%～66%的細(xì)胞染色;5.＞67%的細(xì)胞染色。細(xì)胞染色強(qiáng)度分為4個(gè)級(jí)別:0.陰性(無(wú)染色);1.弱陽(yáng)性(淡黃色);2.陽(yáng)性(黃色);3.強(qiáng)陽(yáng)性(棕黃色)。隨機(jī)選擇有代表性的10個(gè)高倍鏡視野,每個(gè)視野記數(shù)100個(gè)腫瘤細(xì)胞,以二者之和得分將APRIL免疫反應(yīng)性分為3個(gè)級(jí)別:APRIL陰性(0分),APRIL陽(yáng)性(1～6分),APRIL強(qiáng)陽(yáng)性(7～8分)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件,對(duì)計(jì)量資料采用t檢驗(yàn),并分別計(jì)算均數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù),所得結(jié)果表示為±s;對(duì)計(jì)數(shù)資料采用Pear-son χ2相關(guān)分析,P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RTQ-PCR)檢測(cè)APRIL mRNA表達(dá)結(jié)果 68例NSCLC癌組織和遠(yuǎn)端正常組織APRIL mRNA含量分別為0.72±0.06和 0.10±0.04(±s),統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 P ＜0.05。其中36例鱗癌癌組織和其遠(yuǎn)端正常組織APRIL mRNA分別為0.74±0.06和0.10±0.03;32例腺癌癌組織和其遠(yuǎn)端正常組織APRIL mRNA分別為0.70±0.05和0.11±0.04,統(tǒng)計(jì)學(xué)分析均P＜0.05。鱗癌與腺癌癌組織APRIL mRNA水平統(tǒng)計(jì)學(xué)分析無(wú)顯著性差異(0.74±0.06 vs.0.70±0.05,P ＞0.05)(表1,圖1)。

2.2 Western blot檢測(cè)APRIL蛋白表達(dá)結(jié)果 在68對(duì)NSCLC癌組織及配對(duì)遠(yuǎn)端正常組織標(biāo)本中隨機(jī)選取25對(duì)標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果顯示APRIL蛋白在癌組織標(biāo)本中有陽(yáng)性條帶,而在遠(yuǎn)端正常組織無(wú)陽(yáng)性條帶出現(xiàn)(圖2A)?；叶葤呙杞Y(jié)果顯示APRIL蛋白在NSCLC癌組織表達(dá)為0.94±0.12(±s),遠(yuǎn)端正常組織為0.00,統(tǒng)計(jì)學(xué)分析癌組織和遠(yuǎn)端正常組織APRIL蛋白表達(dá)差異明顯(P＜0.001)(圖2B)。

2.3 免疫組織化學(xué)檢測(cè)APRIL蛋白結(jié)果

2.3.1 APRIL蛋白在NSCLC中的定位和表達(dá)

APRIL陽(yáng)性反應(yīng)物質(zhì)呈棕黃色且多位于陽(yáng)性細(xì)胞胞漿/膜上,在50例NSCLC手術(shù)標(biāo)本切片中,APRIL蛋白在46例肺癌組織中呈陽(yáng)性表達(dá)(46/50,92%)(圖3A、B),其中,16例(16/50,32%)APRIL強(qiáng)陽(yáng)性,30例(30/50,60%)APRIL陽(yáng)性,4例(4/50,8%)陰性表達(dá);10例遠(yuǎn)端正常組織中1例(1/10,10%)APRIL表達(dá)陽(yáng)性,9例(9/10,90%)APRIL陰性(圖3C),與癌組織相比,統(tǒng)計(jì)學(xué)分析P＜0.001。

2.3.2 APRIL蛋白表達(dá)與NSCLC臨床病理關(guān)系

APRIL蛋白表達(dá)分別與患者臨床病理資料:性別、年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織學(xué)分型、腫瘤病理分級(jí)、TNM分期等進(jìn)行分析。結(jié)果表明,APRIL蛋白表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.014)、腫瘤病理分級(jí)(P=0.000)和TNM分期(P=0.006)明顯相關(guān),與性別、年齡、組織學(xué)分型無(wú)關(guān)(P均＞0.05)。見表2。

表1 非小細(xì)胞肺癌中APRIL mRNA表達(dá)Tab.1 The expression levels of APRIL mRNA in NSCLC

圖1 非小細(xì)胞肺癌中APRIL mRNA表達(dá)Fig.1 APRIL mRNA expression in NSCLC

圖2 非小細(xì)胞肺癌中APRIL蛋白表達(dá)Fig.2 Expression of APRIL protein in NSCLC

圖3 非小細(xì)胞肺癌組織中APRIL蛋白定位和表達(dá)(SP×200)Fig.3 APRIL protein location and expression in NSCLCby immunohistochemistry analysis(SP×200)Note:A.Squamous cell carcinoma;B.Adeocarcinoma;C.Normal tissue.

表2 APRIL蛋白表達(dá)與NSCLC臨床病理特征的關(guān)系Tab.2 Correlation of APRIL expression in NSCLC to the clinical and pathological parameters

3 討論

腫瘤壞死因子(Tumor necrosis factor,TNF)超家族可誘導(dǎo)多種生物學(xué)效應(yīng),如細(xì)胞的增殖、分化和凋亡等,在機(jī)體的防御、炎癥反應(yīng)及免疫調(diào)節(jié)等過程中起重要作用[6]。增殖誘導(dǎo)配體(A proliferation-inducing ligand,APRIL)是TNF超家族的一員[3],它有多種生物學(xué)作用,如刺激腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)[3,7],調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞凋亡[8],活化核因子NF-kB等[9],并且和體液免疫的調(diào)節(jié)也密切相關(guān)[7,10]。

本研究中,我們首先采用熒光定量PCR技術(shù)分析了APRIL mRNA在NSCLC癌組織及其遠(yuǎn)端正常組織中的表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)NSCLC癌組織中APRIL的水平顯著高于遠(yuǎn)端正常組織(P＜0.05), Western blot和免疫組化技術(shù)研究APRIL的蛋白表達(dá)得到類似的結(jié)果: Western blot顯示APRIL在NSCLC的癌組織表達(dá)顯著高于遠(yuǎn)端正常組織(P＜0.001),免疫組化結(jié)果表明APRIL在NSCLC惡性腫瘤組織中的陽(yáng)性表達(dá)率(92%)顯著高于癌旁正常組織(10%)。這些結(jié)果都提示APRIL在NSCLC患者的癌組織中高水平表達(dá),與施健等[11]報(bào)道APRIL mRNA在肺癌組織中高表達(dá)結(jié)果相一致。在 Western blot分析時(shí)我們發(fā)現(xiàn),在遠(yuǎn)端正常組中未檢測(cè)到APRIL蛋白表達(dá),而同一正常組織標(biāo)本用RTQ-PCR技術(shù)卻能檢測(cè)出APRIL mRNA有低水平表達(dá),究其原因可能與RTQPCR檢測(cè)mRNA有更高的靈敏度有關(guān)。

與TNF家族內(nèi)的其他成員不同,APRIL蛋白首先在高爾基體內(nèi)加工修飾,經(jīng)furin蛋白酶切割裂解后,部分可與 TWEAK結(jié)合形成APRIL的跨膜形式[12],這一理論成果我們?cè)诿庖呓M化結(jié)果中所觀察到的APRIL蛋白主要分布于陽(yáng)性細(xì)胞胞漿/胞膜上得到證實(shí)。在分析APRIL蛋白表達(dá)與患者臨床病理資料的關(guān)系中,我們發(fā)現(xiàn)APRIL表達(dá)與肺腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和嚴(yán)重程度呈正相關(guān),TNM分期中APRIL陽(yáng)性程度雖在Ⅰ、Ⅱ期表達(dá)無(wú)差異,但都顯著低于Ⅲ-Ⅳ期;本課題組用RNA干擾技術(shù)敲低APRIL在結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480中的表達(dá)時(shí)也發(fā)現(xiàn)APRIL與腫瘤的轉(zhuǎn)移和侵襲有關(guān)[13];同時(shí)Okano等[14]在研究APRIL對(duì)人肝細(xì)胞癌的作用時(shí)也發(fā)現(xiàn)APRIL能促進(jìn)肝細(xì)胞增殖與侵襲,這些結(jié)果均說(shuō)明APRIL在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。APRIL在腫瘤中的作用主要通過與其靶細(xì)胞表面的兩個(gè)受體——穿膜蛋白活化物(TACI)和B細(xì)胞成熟抗原(BCMA)結(jié)合發(fā)揮活性[7],但有研究發(fā)現(xiàn)APRIL在肺癌組織中可能是與其第三個(gè)特異性受體——硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(heparansulfate proteoglycans,HSPG)結(jié)合啟動(dòng)下游信號(hào)傳導(dǎo)通路促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)分化[15],至于在非小細(xì)胞肺癌中具體是哪一種信號(hào)傳導(dǎo)通路發(fā)揮作用,本研究將在下一步的工作中進(jìn)行。

綜上所述,APRIL在NSCLC中高表達(dá),而且與NSCLC分化轉(zhuǎn)移有著密切關(guān)系,提示APRIL可能參與腫瘤發(fā)生、演進(jìn)的過程,但是否可以作為NSCLC的一種預(yù)后因子,尚需進(jìn)一步深入研究。

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