TLR4在anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ復合物誘導THP-1細胞表達TF中的作用探討①

嚴一紅 周 紅 周保成 文海平 許國瑩 周 芳 (江蘇大學基礎醫(yī)學與醫(yī)學技術學院,鎮(zhèn)江 212013)

抗磷脂綜合征(Antiphospholipid syndrome,APS)是一種非器官特異性自身免疫性疾病,主要臨床表現(xiàn)為復發(fā)性動、靜脈血栓及習慣性流產[1]。APS患者血清中的高滴度抗磷脂抗體(Antiphospholipid antibody,APL)與其血栓形成密切相關。研究表明,β2糖蛋白 Ⅰ(beta-2-glycoproteinⅠ,β2GP Ⅰ)是APL的主要靶抗原,其與相應抗體(anti-β2GPⅠ)形成復合物,在APS病理過程中發(fā)揮重要作用[2,3]。anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ復合物能夠誘導血液單核細胞表達組織因子(Tissue factor,TF),由TF引發(fā)的外源性凝血是APS血栓形成的主要原因之一[4,5]。進一步研究發(fā)現(xiàn),anti-β2GPⅠ與其抗原β2GPⅠ交聯(lián)于細胞膜表面特異受體,經(jīng)信號轉導系統(tǒng)使細胞表達TF等活性分子,導致血液高凝[6]。近年來,有關細胞表面β2GPⅠ受體的研究及相關信號途徑的探討是APS研究的關鍵問題,其中Toll樣受體4(TLR4)的作用正受到關注。

TLR4是Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)家族成員之一,屬于Ⅰ型跨膜蛋白(TypeⅠtransmembrance protein),是病原微生物模式識別受體[7]。TLR4可以識別多種配體,其中最主要的是來自細菌脂多糖(LPS)。研究發(fā)現(xiàn),TLR4與其相應配體結合后,迅速引起髓樣分化蛋白-2(Myeloid differentiation-2,MD-2)分子的分泌[8]。后者與TLR4的胞外區(qū)相偶聯(lián),形成TLR4/MD-2受體復合物,隨即活化其下游的接頭蛋白——髓樣分化因子88(Myeloid differentiation factor 88,MyD88)。MyD88接著招募下一個信號蛋白,最終激活核因子κ B(Nuclear factor-kappa B,NF-κ B)和有絲分裂原蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase,MAPK)通路,導致相關基因的轉錄[9]。

本研究前期實驗發(fā)現(xiàn),anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ復合物作用于單核細胞株THP-1細胞后,細胞TLR4表達水平上升,提示TLR4受體途徑在其中具有一定的作用。本文重點探討TLR4及其分泌蛋白MD-2、接頭蛋白 MyD88 在 anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ復合物誘導THP-1細胞TF表達中的作用,并采用紫杉醇抑制實驗進一步證明TLR4及相關信號蛋白的轉導效應。

1 材料與方法

1.1 主要材料及試劑 人單核細胞株THP-1(上海中國科學院細胞研究所),DMEM(Gibco公司),超級新生牛血清(杭州吉諾公司),兔抗人TLR4、MD-2多克隆抗體(eBioscience公司),MyD88抗體(Cell signaling公司),非特異性同型對照抗體——R-IgG(武漢博士德生物工程有限公司),Trizol(Invitrogen公司),逆轉錄試劑盒(Toyobo公司),TF活性試劑盒(Assaypro公司),紫杉醇(同田生物技術有限公司),定量PCR試劑盒(杭州博日科技有限公司),ECL顯色試劑(Santa Cruz公司),LPS(Sigma公司),anti-β2GPⅠ抗體和β2GPⅠ(本實驗室制備),CNBr-activatedsepharose-4B(Amersham公司),β2GPⅠ膠聯(lián)親和層析柱(β2GPⅠ-Affi-Gel,本實驗室制備),引物(設計采用primer primer 5.0,由上海生物工程有限公司合成)。

1.2 方法

1.2.1 THP-1細胞的培養(yǎng) 復蘇凍存的THP-1細胞,用DMEM 培養(yǎng)液(含10%新生牛血清,100 U/ml青霉素和100 U/ml鏈霉素),置于37℃、5%CO2飽和濕度的孵育箱培養(yǎng),當細胞長滿培養(yǎng)瓶底部的70%～80%時,給細胞換液并傳代。取傳代5～10次、處于對數(shù)生長期的狀態(tài)良好的細胞用于實驗。

1.2.2 β2GPⅠ與THP-1細胞相應受體結合分析

利用CNBr-activated-Sepharose-4B自制β2GPⅠ膠聯(lián)親和層析柱(β2GPⅠ-Affi-Gel)。采用 anti-β2GPⅠ/β2 GPⅠ復合物(濃度為 100 μ g/ml)與THP-1細胞(1×107)孵育6小時,收集細胞,PBS洗滌3次后,加入1 ml細胞裂解液裂解,4℃10 629 r/min離心10分鐘后取上清,經(jīng)0.02 mol/L Tris-HCl透析過夜后上樣至β2GPⅠ-Affi-Gel柱,分別應用0.03mol/L NaCl的Tris平衡液和0.35 mol/L NaCl的Tris洗脫液洗脫,各步驟均洗滌至流出液吸光度值接近0為止。將收集的樣本流出液、0.03 mol/L NaCl的Tris平衡收集液及0.35 mol/L NaCl的Tris洗脫收集液三份樣本經(jīng)過SDS-PAGE電泳后轉PVDF膜,將膜用5%牛奶封閉1小時后,以抗TLR4抗體為一抗,37℃孵膜2小時。PBS洗滌3次后,再與相應二抗37℃孵育1小時,PBS洗滌3次后采用ECL顯色,并記錄結果。

1.2.3 細胞總RNA的提取和逆轉錄 將THP-1細胞種入6孔板內(2×106/孔),37℃、5%CO2培養(yǎng)24小時后輕輕棄去培養(yǎng)液,換以1 ml無血清DMEM。根據(jù)實驗設計加入不同刺激物處理細胞2小時。紫杉醇抑制試驗則先將紫杉醇與細胞孵育1小時后,再以不同刺激物處理細胞2小時。收集細胞,加入1ml Trizol裂解,混勻后于室溫放置10分鐘充分裂解,按Trizol說明書提取細胞總RNA。逆轉錄按試劑盒要求操作,逆轉錄體系:總 RNA 1 μ g、OligodT 1 μ l、5 ×Buffer 4 μ l、dNTPs(10 mmol/L)2 μ l、RNase Inhibitor 1μ l、ReverTra Ace 1μ l,最后用ddH2O 補足至20 μ l。反應條件:42℃20分鐘,99℃5分鐘,4℃5分鐘。將RNA及逆轉錄的cDNA分別于-70℃和-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 細胞裂解物的制備 收集傳代3～10次的THP-1細胞,種植于6孔板內,濃度為2×106/孔,37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時后棄去上清,加入1 ml無血清DMEM,然后以相應刺激物刺激6小時。紫杉醇抑制試驗先將紫杉醇與細胞孵育1小時后再與相應刺激物作用6小時,收集細胞,加入適量細胞裂解液,于冰上裂解0.5小時,期間每隔10分鐘劇烈震蕩一次,4℃10 629 r/min離心10分鐘后取上清,測定蛋白濃度,-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 熒光定量PCR檢測 分別設計TLR4、MD-2、MyD88、TF、GAPDH 基因的 PCR引物序列(表 1),行熒光定量PCR檢測。反應體系為:2×SYBR Mix 10 μ l,上下游引物各 0.5 μ l,TaqDNA Polymerase 0.12 μ l,最后用滅菌 ddH2O補足至 20 μ l。Real-time PCR循環(huán)參數(shù)為:94℃預變性5分鐘,一個循環(huán);94℃30秒,60℃(TLR4、MD-2、MyD88、TF)/56℃(GAPDH)30 秒,72℃30秒,35個循環(huán)擴增。目的基因的相對表達水平=目的基因拷貝數(shù)/GAPDH拷貝數(shù)。

1.2.6 Western 蛋白印跡分析 取收集的總蛋白30 μ g與樣本緩沖液作用,94℃變性3分鐘后以12%SDS-PAGE電泳分離蛋白,再以350 mA恒流轉印至PVDF膜;膜置于含有5%脫脂牛奶的TBS/T室溫封閉1小時;再分別用相應的兔抗人TLR4(1∶1 500)、兔抗人MD-2(1∶500)及兔抗人MyD88(1∶1 000)抗體4℃孵育過夜,次日用TBS/T洗滌3次,15 min/次,采用HRP標記的羊抗兔IgG抗體(1∶500),37℃孵育1小時,TBS/T洗滌3次,15min/次,ECL顯色系統(tǒng)定影顯色,觀察雜交條帶。

1.2.7 TF活性檢測 利用TF/Ⅶa復合物使因子Ⅹ轉變?yōu)榛罨蜃英鷄,根據(jù)Ⅹa生成量來判定細胞TF的活性。測定標本為細胞裂解物,嚴格按照試劑盒說明操作。在96孔反應板中加入50 μ l的樣品稀釋液和10 μ l的因子Ⅶ后,分別加入倍比稀釋的標準品和測定樣本10 μ l,以樣品稀釋液為空白,37℃反應30分鐘后,加入因子Ⅹ。37℃反應30分鐘后再加入Ⅹa的發(fā)色底物,于405 nm、37℃條件下測定吸光度值。吸光度值高低和樣品中TF活性呈正相關,TF活性結果以pmol/L表示。

1.3 統(tǒng)計學分析 采用軟件SPSS10.0進行統(tǒng)計學分析,所有數(shù)據(jù)以±s表示。對各組數(shù)據(jù)進行成組資料的t檢驗分析,P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 Anti-β2GPⅠ /β2GP Ⅰ誘導 THP-1細胞表達TF mRNA及活性 本研究組已證明anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ復合物能夠誘導血液單核細胞表達TF活性[3,5],此次觀察了單核細胞株THP-1細胞的情況。由圖1可見,anti-β2GP Ⅰ/β2GP Ⅰ復合物(100 μ g/ml)能夠顯著增加THP-1細胞的TF mRNA水平(圖1A),并增強細胞的TF活性(圖1B),與未加任何處理的THP-1細胞(Control)比較,差異顯著(P＜0.05);而非特異性同型對照抗體— —R-IgG/β2GPⅠ(100 μ g/ml)復合物則沒有此作用(圖1)。本實驗以LPS(500 ng/ml)刺激細胞為陽性對照。

表 1 TLR4、MD-2、MyD88、TF和 GAPDH 基因引物序列Tab.1 Sequences of TLR4,MD-2,MyD88,TF and GAPDH gene primers

2.2 β2GPⅠ與THP-1細胞相應受體結合 本實驗室自制的β2GPⅠ-Affi-Gel柱經(jīng)估算,β2GPⅠ蛋白偶聯(lián)率達85.8%。將與anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ復合物孵育過的THP-1細胞,裂解后經(jīng)β2GPⅠ-Affi-Gel柱親和層析,再利用抗TLR4抗體對層析后的標本進行 Western 蛋白印跡分析。結果顯示:樣本流出液及0.03mol/L NaCl的Tris平衡收集液中沒有檢測到TLR4目的條帶,而經(jīng)0.35 mol/L NaCl的Tris洗脫液洗脫后,在100 kD處可檢測到清晰的TLR4目的條帶(圖2),表明 anti-β2GPⅠ/β2GP Ⅰ復合物能夠與細胞膜上TLR4結合。

2.3 Anti-β2GPⅠ/β2 GP Ⅰ增 強 THP-1 細 胞 TLR4、MyD88、MD-2的表達 實驗同樣設立未處理THP-1細胞的空白對照(Control)及LPS刺激的陽性對照。結果顯示 :經(jīng)anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ(100 μ g/ml)刺激 2小時 后 ,THP-1細胞TLR4 、MyD88 、MD-2mRNA表達均顯著增加(圖3A),與空白比較差異顯著(P＜0.05)。另外, Western 蛋白印跡分析刺激6小時后相應的蛋白水平,與未刺激的空白比較,觀察到TLR4、MyD88、MD-2蛋白表達也有明顯的增強,條帶增粗,密度增厚(圖3B)。

圖1 Anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ 誘導的 THP-1 細胞 TF mRNA(A)表達及TF活性(B)Fig.1 Anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ-induced THP-1 cells TF mRNA(A)expression and TF activity(B)

2.4 紫杉醇抑制anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ誘導THP-1細胞TLR4、MyD88、MD-2 的表達 將 1 μ mol/L 紫杉醇與THP-1細胞預孵育 1小時后,再以 anti-β2GPⅠ/β2GP Ⅰ 復合物(100 μ g/ml)刺激細胞,觀察 TLR4、MyD88、MD-2 mRNA和蛋白水平的變化 。圖4結果顯示,經(jīng)紫杉醇處理后,anti-β2GP Ⅰ/β2 GPⅠ復合物不能增加THP-1細胞的TLR4、MyD88及MD-2 mRNA的表達(圖4A),與對照比較無顯著差異(P＞0.05);并且,相應的蛋白水平從條帶上觀察也無明顯增強(圖4B)。

圖2 β2GPⅠ與THP-1細胞相應受體TLR4結合分析Fig.2 Analysis of β2GPⅠ binding with THP-1 cells-related receptor TLR4

圖 3 Anti-β2GP Ⅰ/β2GPⅠ 誘 導 的 THP-1 細 胞 TLR4、MyD88、MD-2 mRNA(A)及蛋白(B)的表達Fig.3 Anti-β2G PⅠ/β2G PⅠ-induced THP-1 cells TLR4,MyD88,MD-2 mRNA(A)and protein(B)expression

圖4 紫杉醇抑制 anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ復合物誘導的 THP-1細胞 TLR4、MyD88、MD-2 mRNA(A)及蛋白(B)的表達Fig.4 Paclitaxel inhibits anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ-induced THP-1 cells TLR4,MyD88,MD-2 mRNA(A)and protein(B)expression

圖5 紫杉醇抑制 anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ復合物誘導的 THP-1細胞 TF mRNA表達(A)及 TF活性(B)Fig.5 Paclitaxel inhibits anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ-induced THP-1cells TF mRNA(A)expression and TF activity(B)

2.5 紫杉醇抑制anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ誘導THP-1細胞TF表達 上述結果表明紫杉醇能夠抑制TLR4及相關分子的表達。本實驗進一步觀察紫杉醇抑制TLR4表達以后,是否影響 anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ復合物誘導THP-1細胞TF的表達。結果顯示:經(jīng)紫杉醇預處理的THP-1細胞,anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ復合物刺激后,與Control相比,細胞的TF mRNA表達(圖5A)和TF活性(圖5B)均無明顯變化(P＞0.05),表明TLR4及其相關分子在anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ復合物誘導THP-1細胞表達TF的過程中至關重要。

3 討論

Toll樣蛋白最早發(fā)現(xiàn)于果蠅,它是果蠅對抗病原微生物感染中的重要受體。接著Medzhitov[10]等發(fā)現(xiàn)哺乳動物體內有與果蠅相似的Toll蛋白,并命名為Toll樣受體(TLRs)。至今在人類已發(fā)現(xiàn)11種TLRs(TLR1～TLR11),TLR4是第一個被認識的人類Toll樣受體蛋白,廣泛分布于單核巨噬細胞、淋巴細胞及肝臟、脾臟等組織,是人類天然免疫的重要受體。TLR4屬于Ⅰ型跨膜蛋白,由胞外區(qū)、胞漿區(qū)和跨膜區(qū)三個部分組成,主要參與由LPS誘發(fā)的信號轉導。最早發(fā)現(xiàn)LPS的識別受體是CD14,但由于CD14無跨膜結構,不能將信號轉導至胞內,TLR4及MD-2的發(fā)現(xiàn)是對LPS認識的突破性進展。MD-2是一個小分子分泌蛋白,正常情況下,單核細胞僅有少量表達,在LPS的刺激作用下,MD-2分泌增加,同時促進TLR4向細胞膜轉移和表達。在對LPS的識別過程中,TLR4和MD-2以復合物的形式作為共同受體,缺一不可[11]。TLR4一旦活化,有兩條途徑參與TLRs的激活及后續(xù)信號轉導,主要區(qū)別在于其胞內接頭蛋白的不同,由此分為MyD88依賴性途徑和MyD88非依賴性途徑。其中MyD88通過其羧基(C)端與TLR4胞內區(qū)發(fā)生同源性相互作用,其氨基(N)端(又名死亡結構域)又招募下一個信號蛋白,最終活化NF-κ B和MAPK信號通路,參與炎癥、腫瘤及其他多種疾病的病理過程[12]。

近年來的研究提示TLR4與APS病理機制密切相關[13],APL誘導單核細胞表達TF可能涉及到TLR4。本研究組采用流式細胞分析,發(fā)現(xiàn)anti-β2 GPⅠ/β2GPⅠ復合物刺激THP-1細胞后TLR4表達顯著增加(結果未顯示)。這一有趣的結果促使我們深入探討TLR4及相關信號分子在anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ復合物誘導THP-1細胞表達TF中的作用。我們首先明確了anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ復合物對THP-1細胞TF表達的誘導作用(圖1)。然后,將anti-β2GPⅠ/β2GP Ⅰ復合物刺激過的THP-1細胞裂解物通過β2GPⅠ-Affi-Gel親和層析柱,利用抗TLR4抗體分析經(jīng)鹽洗脫液后樣本中是否含有TLR4。結果驗證,細胞膜上TLR4能夠結合到 β2GPⅠ-Affi-Gel柱上, Western 蛋白印跡顯示洗脫液中有TLR4的反應條帶(圖2所示)。在此基礎上進一步觀察 anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ復合物刺激THP-1細胞后,TLR4及其相關信號啟動分子MD-2和MyD88的表達情況。結果發(fā)現(xiàn),antiβ2GPⅠ/β2GPⅠ復合物能夠產生與LPS相同的刺激效應,顯著增加細胞表達TLR4、MD-2及MyD88 mRNA及蛋白的水平(圖3)。本小組前期研究表明,單核細胞表面的膜聯(lián)蛋白A2(AnnexinA2)可作為antiβ2GPⅠ/β2GPⅠ復合物的受體,介導復合物與細胞結合[14,15]。然而Annexin A2缺乏膜內結構,不能將胞外的信號轉導至細胞內,TLR4可能與Annexin A2組成復合受體,參與其信號轉導過程,本小組正在進行這方面的深入研究。另外,研究表明在分子結構上,β2GPⅠ與 TLR4的特異性配體——某些病毒或細菌的結構存在相似性[16,17],因此,β2GPⅠ是否能直接刺激TLR4的表達并與其結合,從而引發(fā)后續(xù)的信號轉導,值得探討?？傊?本研究表明TLR4及其信號轉導分子在 anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ復合物作用于細胞過程中擔當重要角色。

為充分闡明TLR4及其信號分子在anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ復合物刺激THP-1細胞表達TF中的作用,本實驗采用TLR4途徑抑制劑——紫杉醇,觀察對細胞表達上述分子及TF的影響。紫杉醇(Paclitaxel)是一種常見的抗癌藥,近年研究發(fā)現(xiàn),紫杉醇可以通過與MD-2結合,掩蓋TLR4配體的受體結合位點而起到抑制TLR4信號通路的作用[18,19]。本研究利用紫杉醇的這一特性,觀察紫杉醇是否干預anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ對THP-1細胞的作用。結果證明,紫杉醇不僅抑制了 anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ 復合物誘導的TLR4、MD-2表達,也抑制了TLR4接頭蛋白 MyD88的表達,同時也干預了細胞TF的表達。必須強調的是,在用紫杉醇進行實驗的過程中,我們通過預實驗選擇合適濃度及作用時間,排除了紫杉醇本身對細胞的毒性影響。

綜上所述,本研究進一步明確了anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ復合物刺激單核細胞株THP-1表達TF的作用;證明細胞膜TLR4 能夠與β2GPⅠ結合;anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ復合物通過TLR4信號轉導途徑,最終促進細胞表達TF,從而參與APS血栓形成。紫杉醇可以干預這一過程,提示可作為APS血栓形成的預防及治療藥物應用。

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