小鵝瘟病毒的分離鑒定與臨床病變觀察

何經緯，劉 晶，湯文杰

（1.四川省畜禽繁育改良總站，四川 成都 610041；2.四川省南充市高坪區(qū)馬家小學，四川 南充 637100；3.中國科學院亞熱帶農業(yè)生態(tài)研究所，湖南 長沙 410125）

本研究采集患病雛鵝樣本通過鵝胚分離病毒進行病原學研究與血清學檢測，再以感染鵝胚尿囊液人工接種8日齡健康雛鵝，觀察在臨床上的主要病理變化特征?，F(xiàn)將結果報告如下：

1 材料與方法

1.1 材料 試驗動物：50只1日齡健康的四川白雛鵝，購自雅安非小鵝瘟疫區(qū)，12～15孵化日齡非免疫鵝胚30枚；小鵝瘟病毒毒株:由四川農業(yè)大學禽病防治研究中心分離自四川省樂山市10日齡患小鵝瘟死亡的四川白雛鵝；小鵝瘟標準陽性血清（本實驗室保存）。1mL無菌注射器10支（12號針頭，5mm）、碘酒、酒精棉球、手術剪、紗布、研缽、冰箱、離心機、毛細管、超凈工作臺、高壓滅菌器、孵化器、照卵器、記號筆、試管（10支）、青霉素空瓶（20個），青鏈霉素（各100萬單位）、氯化鈉、瓊脂，飼料7.5kg，相關養(yǎng)鵝器具。

1.2 方法

1.2.1 病樣采集及處理 用無菌方法取患病雛鵝的肝臟、腦、腸等器官病料置滅菌的玻璃器皿中冷凍保存，作為病毒的分離材料。先將病料剪碎、磨細，用滅菌PBS液作1∶5倍稀釋，反復凍融3次，經3000 r/min離心30min，取上清液添加青鏈霉素（終濃度為10000單位/mL），經細菌學檢驗為陰性者置于4℃冰箱中保存為接種材料。

1.2.2 病毒返強試驗 飼養(yǎng)1日齡雛鵝10只，肌肉注射尿囊毒液每只0.2～0.5mL。選擇10日內有典型臨床癥狀的死亡雛鵝，取其肝、腦于研缽內，剪碎、研磨，用生理鹽水（含雙抗1萬單位/mL）制成5倍乳劑，經5 000 r/min離心10min，反復凍融數次，取上清置于4℃冰箱中過夜（反復幾次，直到死亡率達60%～80%）。

1.2.3 鵝胚接種 用上述接種材料接種12～15孵化日齡非免疫鵝胚30枚。參看文獻進行尿囊腔接種，每枚胚尿囊腔注射0.2～0.5mL。38℃繼續(xù)孵化5～8d，24h內死亡者棄去。每隔8h照蛋觀察一次，收集24～120h死亡的胚置于4℃冰箱內，冷卻收縮血管，12h后無菌收集尿囊液，添加青鏈霉素（終濃度10000單位/mL），靜置作用2h，凍存。注意觀察鵝胚頭、四肢病理解剖變化。

1.2.4 瓊脂擴散試驗 被檢測抗原制備：取患病雛鵝的肝臟、腦、腸等器官病料置滅菌的玻璃器皿中剪碎、磨細，用無菌生理鹽水作1∶2～1∶3倍稀釋，4℃冰箱中凍融2次。經3000 r/min離心30min，取上清液加入等量的氯仿，振搖30min。經3 000 r/min離心30min，取上清液凍融1次，再經3 000 r/min離心30min，取上清液加入等量的氯仿，振搖30min。又經3 000 r/min離心30min，舍去上清液，收集病毒沉淀物。取0.01M的PBS（pH 7.2）適量懸浮病毒沉淀，加入0.1%的甲醛滅活后，即為小鵝瘟病毒沉淀抗原。

瓊脂平板制備：在1 000mL生理鹽水中加入優(yōu)質瓊脂1g，加熱使其完全溶解后，調整pH值至7.8澆鑄成3mm厚的平板，待冷卻后打孔。中央1孔，周圍6孔，孔徑3mm，孔距4mm，并用熔化瓊脂封底。

檢測方法：用已知診斷抗血清來檢測制備的抗原，中央孔加入診斷抗血清，周圍孔加入 1∶4、1∶6、1∶8 倍稀釋的被檢測抗原，并設置一組重復。將加樣后的瓊脂平板置于濕盒中，37℃恒溫培養(yǎng)，每隔12 h觀察1次，至48 h結束，記錄結果。

1.2.5 雛鵝人工感染試驗 攻毒前，先將50只1日齡四川白雛鵝（其中20只為試驗組，10只為同居組，20只為對照組）。飼養(yǎng)在未被小鵝瘟病毒污染的環(huán)境中，觀察7d以確保其為健康雛鵝。7d后試驗組進行滴鼻接種感染鵝胚尿囊液（1mL/只），同居組、對照組不作任何處理。在此后的 10min、30min、60min、90min、4h、12h、48h、72h、9d、15d 解剖試驗組、同居組、對照組小鵝各2只，取心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、腦、胸腺、哈德氏腺、法氏囊、食管、氣管、腸等部位觀察剖檢變化。

2 結果與分析

2.1 鵝胚接種結果 將采集后處理過的病料接種于30只鵝胚，24h內未見死亡的鵝胚，鵝胚在2～7 d死亡的有25只，計算該病毒對鵝胚的致死率為84%。無菌條件下收集尿囊液，每枚約收集尿囊液4～6mL。觀察鵝胚病變：尿囊液透明清亮；絨毛尿囊膜有出血點；胚體充血、出血。

2.2 病毒返強試驗結果 第1次病毒返強時，10日內10只雛鵝死亡8只，死亡率為80%，已達到病毒返強目的，故共只有1次病毒返強試驗。雛鵝死亡時間分布見表1。

表1 小鵝瘟病毒返強時雛鵝死亡時間分布

2.3 瓊擴結果 在中央孔加入診斷抗血清，周圍1、2、3 孔內分別加入 1∶4、1∶6、1∶8 倍稀釋的被檢測抗原，1′、2′、3′為一組重復。該抗原在瓊脂擴散試驗中能夠與小鵝瘟陽性血清出現(xiàn)沉淀線，屬于陽性反應，且與小鵝瘟標準抗原形成的沉淀線相吻合。見圖1。

圖1

2.4 滴鼻攻毒組臨床癥狀 從第8 d開始有攻毒鵝因小鵝瘟病毒致死，從第10 d開始有同居鵝因小鵝瘟致死。死前癥狀：兩腿呈劃水狀，喙端、爪尖發(fā)紺。繼續(xù)觀察各組的臨床表現(xiàn)，攻毒組、同居組都表現(xiàn)為精神萎頓，食欲減退，不愿活動，出現(xiàn)嚴重下痢，排灰白色或青綠色稀糞，糞中帶有纖維碎片或未消化的飼料等，臨死前頭觸地，兩腿抽搐。對照組的雛鵝生長情況良好。

2.5 雛鵝人工感染試驗剖檢結果 滴鼻組解剖變化：肝臟有出血點或淤血，膽囊充盈，心臟部分部位有點狀出血，十二指腸彌漫性出血，腸壁變薄，盲腸有香腸樣栓塞，泄殖腔潴留少量黃白色液體，腦膜充血、出血。這與相關資料報道的相一致。同居組解剖變化：肝臟有出血點，膽囊充盈，脾臟腫大，心臟部分部位有點狀出血，十二指腸彌漫性出血，盲腸有香腸樣栓塞，泄殖腔有出血且潴留少量黃白色液體，腦膜充血。

同居組死鵝幾乎與攻毒組死鵝有同樣的臨床表現(xiàn)和解剖變化，差別只是攻毒組的發(fā)病時間比同居組的早。

3 討論

3.1 小鵝瘟病毒感染小鵝后主要表現(xiàn)為體液免疫反應，首先出現(xiàn)IgM，然后是IgG，康復的雛鵝以及經過隱性感染的成年鵝均能產生高水平的病毒中和抗體和沉淀抗體，并持續(xù)很長時間，還能將抗體通過卵黃傳給后代，使孵出的雛鵝免于發(fā)病。以小鵝瘟病毒抗原反復免疫兔、牛、羊、豬等動物，也能產生高水平的病毒中和抗體和沉淀抗體，并可用于小鵝瘟病毒感染的預防和治療。將小鵝瘟病毒通過非免疫鵝胚傳代增殖，取感染胚尿囊液制備小鵝瘟病毒沉淀抗原，該抗原在瓊脂擴散試驗中能夠與小鵝瘟陽性血清出現(xiàn)沉淀線。本試驗結果表明，本次制備的小鵝瘟病毒沉淀抗原可以用于小鵝瘟臨床免疫效果監(jiān)測和流行病學調查，對其研究、診斷和防治具有實用價值。

3.2 關于小鵝瘟病毒沉淀抗原的制備，國內資料報道了4種方法：王永坤等將感染的尿囊液裝入透析袋硅膠濃縮；郝虹等采用0.40 kg/L飽和度的硫酸銨鹽析處理；王新海通過差速離心法提取抗原；程由銓等使用聚乙二醇（PEG）沉淀病毒。按照病毒學理論，病毒一般在0.45 kg/L以上飽和度的硫酸銨鹽析中發(fā)生沉淀，0.40 kg/L的飽和度不可取。差速離心法需要使用40000 r/min的轉速，這不是普通實驗室的離心設備所能達到的，而且在實際應用中也不易操作。本次試驗采用反復離心加氯仿抽提的方法成功地制備了小鵝瘟病毒沉淀抗原，是一種快速、有效的制備方法，具有廣泛的應用價值。

3.3 瓊脂擴散試驗是根據可溶性抗原與可溶性抗體在含有電解質的瓊脂網狀基質中向四周自由擴散，由近向遠形成濃度梯度的原理而進行的。當抗原與抗體在瓊脂基質中適合比例下相遇，便可相互結合，產生抗原抗體復合物，出現(xiàn)肉眼可見的沉淀線。影響瓊脂擴散試驗的因素有：（1）反應物的濃度。兩反應物濃度越高，所形成的沉淀線越清晰。（2）反應的溫度。在一定的范圍內（如0～37℃）溫度越高，物質擴散速度越快，沉淀線形成越快。為減少沉淀線的變化，并保持清晰度，可在37℃形成沉淀線后置溫室或冰箱中。（3）反應時間。沉淀線一般1～3d出現(xiàn)，14～21d數目最多，只有在適當的時間內，才可以見到清晰的線條，時間太長則可能出現(xiàn)沉淀線的分裂、溶解、擴散甚至消失。此外沉淀線的形成還與反應物的性質、瓊脂的濃度、抗原抗體孔間距離等有關。

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