三個遺傳性血小板無力癥家系的表型和基因型診斷分析

秦歡歡,王學(xué)鋒,許冠群,陸曄玲,丁秋蘭,戴 菁,奚曉東,王鴻利

(1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院、上海血液學(xué)研究所;醫(yī)學(xué)基因組學(xué)國家重點實驗室,上海200025;2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院臨床輸血科)

血小板無力癥是由于血小板糖蛋白IIb(GPIIb)或者IIIa(GPIIIa)的基因缺陷導(dǎo)致血小板對多種誘導(dǎo)劑(如腺苷二磷酸、膠原、花生四烯酸、腎上腺素)先天性、遺傳性反應(yīng)減低甚至無反應(yīng)。本病為一種常染色體隱性遺傳的血小板功能障礙性疾病。血小板無力癥根據(jù)GPIIb/IIIa復(fù)合物量的減少或者質(zhì)的異常分為3型:Ⅰ型GT(IIb/IIIa＜5%)占大多數(shù)(78%)。Ⅱ型GT(IIb/IIIa占5%-25%)約占14%。Ⅲ型GT(IIb/IIIa)又稱變異型GT約占40%-100%。目前關(guān)于GT基因缺陷報道包括基因點突變、缺失、插入、重排,絕大多數(shù)為點突變。本研究中對3例血小板無力癥家系進行臨床診斷和家系調(diào)查共發(fā)現(xiàn)6種純合性基因突變,其中先證者3基因純合性插入及多位點突變?yōu)閲H首次報道。

1 對象與方法

1.1 家系資料

家系1:先證者,女,14歲。出生后3-4天就有皮膚出血點、口腔牙齦出血。12歲初潮,月經(jīng)量多持續(xù)時間長。其母有鼻出血,但月經(jīng)量不多。其父無出血史。家系圖見圖1a。

家系2:先證者,女,14歲。出生后10個月開始鼻出血,感冒后會自發(fā)性鼻出血、牙齦出血。皮膚可見明顯出血點。其外公及爺爺有出血病史。家系圖見圖1b。

家系3:先證者,女,12歲。自幼有牙齦出血、鼻出血、耳出血、咽出血及皮膚瘀斑,家族無類似出血病史。家系圖見圖1c。

以上3個家系先證者均為漢族,父母為近親婚配。

圖1 三個遺傳性血小板無力癥家系圖

1.2 方法

1.2.1篩選試驗 血小板計數(shù)及模板法檢測出血時間(BT),全血涂片觀察血小板的形態(tài)和分布。

1.2.2確診實驗 二磷酸腺苷(ADP)、腎上腺素、花生四烯酸、膠原和瑞斯托霉素誘導(dǎo)的血小板聚集試驗(PAgT)及全血法流式細胞術(shù)(flow cytometry,FCM)檢測血小板表面CD41(αⅡb)和CD61(β3)表達。

1.2.3排除實驗 通過檢測常規(guī)凝血項目包括活化部分凝血活酶時間(APTT)、凝血酶原時間(PT)、凝血酶時間(TT)及纖維蛋白原(Fg)含量排除凝血障礙性疾病,通過檢測血管性血友病因子抗原(vWF:Ag)及其活性(vWF:A)以排除血管性血友病(von Willebrand’s disease,vWD)。

1.2.4αⅡb及β3基因分析 采集先證者及家系成員外周血2.7 ml,1∶9枸櫞酸鈉抗凝,立即4℃、3 000 r/min離心15 min收集上層血漿。利用北京天根生物公司DNA抽提試劑盒抽提先證者及其家系成員外周血基因組DNA。引物序列及反應(yīng)體系條件見參考文獻[1,2]。先擴增先證者αⅡb及β3基因各外顯子及側(cè)翼序列,PCR產(chǎn)物經(jīng)割膠純化后,用末端標記雙脫氧法標記后測序(美國ABI公司DNA測序儀ABI3130XL),用Chromas軟件將測序結(jié)果與美國NCBI基因庫所公布的序列進行比對,3次正反測序證實。家系成員DNA僅在先證者αⅡb及β3基因突變區(qū)域擴增、純化后測序,以確定突變基因的存在及突變類型。同時針對新的突變位點,通過檢索單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP)及對100名健康人中進行相應(yīng)區(qū)域的PCR擴增、純化后DNA直接測序的方法進行多態(tài)性篩查。通過查詢ISTH數(shù)據(jù)庫(http://sinaicentra1.mssm.edu/intranet/research/glanzmann)及相關(guān)文獻查詢證實新突變。

2 結(jié)果

2.1 實驗室檢測結(jié)果

2.1.1血涂片3個先證者全血涂片觀察血小板形態(tài)正常,多散在分布、不聚集,血小板計數(shù)均正常。出血時間均延長。

2.1.2PAgT 3個先證者對二磷酸腺苷(ADP)、腎上腺素、花生四烯酸、膠原等生理性誘聚劑反應(yīng)低下或者無反應(yīng),而對瑞斯托霉素的反應(yīng)基本正常。全血流式細胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)3例先證者血小板膜表面αⅡβ3表達明顯減少甚至缺如。

2.1.33個先證者及其家系成員的凝血四項檢查(包括APTT、PT、TT、Fg)及vWF:Ag 及vWF:A 均基本正常。家系成員檢測結(jié)果略。(見表1)。

2.1.4αⅡ及β3基因分析

3個先證者αⅡb基因30個外顯子及側(cè)翼序列及β3基因15個外顯子及側(cè)翼序列通過Chromas軟件分析,αⅡb及β3基因分別與Genebank數(shù)據(jù)庫中(GI:195546903)及(GI:195546904)比對,共發(fā)現(xiàn)6種純合突變均位于αⅡb基因上(見表2)。先證者1在αⅡb基因的17號外顯子存在14502C＞T純合性突變,其母親具有與其相同的C＞T雜合性改變。先證者2在αⅡb基因26號外顯子存在18859C＞T純合性突變,其父親、母親、弟弟及其他部分家系成員具有與其相同的雜合性突變。先證者3在αⅡb基因的15號外顯子第14103-5 14104位核苷酸之間發(fā)生純合性插入T(14103-14104insT),同時又發(fā)生3個點突變14105A＞C、14106G＞C、14107A＞T導(dǎo)致編碼GPIIb蛋白的第418-483位氨基酸發(fā)生移碼突變。其父親、母親、奶奶及曾外婆具有與其相同的雜合性插入及3個雜合性點突變(圖2)。

表1 3例GT家系先證者實驗室檢測結(jié)果

表2 3例GT家系先證者基因檢測結(jié)果

圖2 3個先證者及部分家系成員測序圖

3 討論

整合素αⅡbβ3是血小板膜上表達最豐富的一種糖蛋白,當血小板處于活化狀態(tài)時,可以結(jié)合纖維蛋白原、血管性血友病因子(vWF)及纖維連接蛋白等多種黏附分子,在血小板黏附聚集過程中起關(guān)鍵作用。整合素αⅡbβ3是一種鈣離子依賴性異二聚體,在鈣離子參與下以1∶1比例構(gòu)成復(fù)合物,αⅡb或者β3任一亞基發(fā)生突變都會影響復(fù)合物的形成及細胞表面的表達,從而導(dǎo)致血小板無力癥。

本研究中3例先證者父母均為近親婚配,先證者自幼就反復(fù)出現(xiàn)皮膚瘀斑、瘀點,鼻出血及牙齦出血,臨床表型診斷血涂片可見形態(tài)正常的血小板分散存在無聚集,血小板計數(shù)正常,出血時間明顯延長,凝血象正常,血小板對多種生理性誘導(dǎo)劑反應(yīng)低下或者缺無,而對瑞斯托霉素反應(yīng)正?；蛘呓咏！Ａ魇郊毎g(shù)發(fā)現(xiàn)αⅡb及β3含量比正常人明顯減低,確診為GT。由于GT是一種常染色體隱性遺傳病,雜合子通常不發(fā)病,本研究中的3個先證者均為純合性基因突變,父母均為該位點的雜合性基因突變。3例先證者的父母臨床上均無出血表現(xiàn)。

家系1先證者在αⅡb基因的17號外顯子存在14502位存在C→T的純合基因突變,導(dǎo)致553位氨基酸由精氨酸(R)變?yōu)榻K止密碼子(stop),母親為該位點的雜合性突變,父母為近親婚配,推測其父親也應(yīng)為該位點的雜合性突變。該位點突變是引起GT的熱點突變,包括本研究中家系1在內(nèi)已在10例GT患者中有報道,其中8例無血緣關(guān)系[3-6]。該突變發(fā)生在17號外顯子的3’端剪切位點附近,有文獻報道此突變可以激活17號外顯子內(nèi)潛在剪切位點,導(dǎo)致17號外顯子末端75 bp的缺失,導(dǎo)致相應(yīng)的25個氨基酸的缺失[6]。

家系2先證者在αⅡb基因的26號外顯子存在18859位存在C→T的純合基因突變,導(dǎo)致860位氨基酸由谷氨酰胺(Q)變?yōu)榻K止密碼子(stop),父母親為該位點的雜合性突變,本研究小組于2008年1月及2009年3月兩次報道過該位點的雜合性突變[7,8],提示該位點也是引起I型GT的熱點突變。本研究小組曾在2007年做過該突變位點的體外表達試驗,共轉(zhuǎn)染αⅡb Q860stop突變質(zhì)粒及野生型質(zhì)粒β3的293T細胞培養(yǎng)48小時后收獲細胞,Western blot顯示其細胞內(nèi)GPIIb蛋白含量與共轉(zhuǎn)朵野生型αⅡb及P3質(zhì)粒的細胞明顯差異,但蛋白分子量明顯降低,提示終止密碼的提前出現(xiàn),造成了蛋白翻譯的提前終止,產(chǎn)生了截斷蛋白[8]。之前也有報道發(fā)生在26號外顯子純合突變870位絲氨酸(Ser)突變?yōu)榻K止密碼子,該突變導(dǎo)致αⅡb的穿膜區(qū)及胞質(zhì)區(qū)的缺失,產(chǎn)生截斷蛋白能與β3亞基在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中形成復(fù)合物,但不能進行翻譯后加工,導(dǎo)致不能成熟表達于血小板表面[9],導(dǎo)致GT發(fā)生。

家系3先證者在αⅡb基因的15號外顯子靠近3’端14103與14104位之間純合性插入T,導(dǎo)致移碼突變,同時其后的3個核苷酸又發(fā)生純合性點突變,分別為14105A＞C、14106G＞C、14107A＞T,其父母、奶奶及曾外婆均為與其相同的雜合性插入突變及雜合性點突變,可見這個插入突變與之后的3個點突變位于同一條染色體上。此插入性突變之后又引起的多個位點的點突變目前國際上尚未有類似報道[10]。筆者推測可能由于插入堿基T后引起血小板糖蛋白IIb結(jié)構(gòu)變化,蛋白結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定導(dǎo)致之后多個位點發(fā)生點突變。先證者的父母為近親婚配,父母均具有與先證者相同的雜合突變。流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示αⅡb及β3均降低至1%左右,推測此插入突變及多個位點的點突變可能改變αⅡb糖蛋白空間結(jié)構(gòu),影響αⅡbβ3復(fù)合物的形成,導(dǎo)致 I性GT發(fā)生[11,12]。關(guān)于此多個位點復(fù)合突變對αⅡbβ3復(fù)合物合成轉(zhuǎn)運及功能的影響需進一步研究證實。

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