腦出血大鼠腦內(nèi)NGF和BDNF蛋白表達(dá)變化的研究

石秋艷 何俊芳 孫惠芳 孫 鵬 劉 斌 張國志 王長友 燕 霞

1 華北煤炭醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院（063000）

2 唐山市鐵路中心醫(yī)院（063000）

3 河北工程大學(xué)附屬醫(yī)院（056002）

神經(jīng)營養(yǎng)因子是一組由多細(xì)胞分泌的對神經(jīng)組織起特殊營養(yǎng)作用的蛋白質(zhì)和多肽分子。它們不僅能夠促進(jìn)發(fā)育中神經(jīng)元的成熟與分化，而且還能夠阻止損傷后神經(jīng)元的死亡，促進(jìn)其再生。目前關(guān)于腦出血后神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達(dá)及分布規(guī)律的文獻(xiàn)報道較少，本實(shí)驗(yàn)旨在研究神經(jīng)生長因子（nerve growth factor，NGF）和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）在大鼠腦出血后變化規(guī)律及其特點(diǎn)，探討神經(jīng)營養(yǎng)因子在腦出血后的保護(hù)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

健康的雄性SD大鼠（北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司）；NGF、BDNF多克隆抗體，二抗試劑盒及DAB顯色劑（武漢博士德公司產(chǎn)品）；立體定位儀。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物的分組

實(shí)驗(yàn)SD大鼠，體質(zhì)量200～300g，隨機(jī)分成正常組、假手術(shù)組和腦出血組，正常組6只，其余各組隨機(jī)按時間動態(tài)分為術(shù)后3、6、12、24、72h、7d，每個時間點(diǎn)各6只。

1.3 模型的制作

參照Deinsberer等報道的方法[1]，大鼠以10%水合氯醛腹腔麻醉（0.035mL/kg），固定于立體定位儀上，于前囟前0.2mm中線向左側(cè)旁3mm處鉆一直徑約為1mm的小孔，斷尾取血，用微量注射器沿鉆孔方向?qū)?0mL的不凝血緩慢注入左側(cè)尾狀核，留針10min，之后緩慢退針，縫合頭皮。假手術(shù)組除不注射自體血外，余操作同實(shí)驗(yàn)組。實(shí)驗(yàn)過程中出現(xiàn)大鼠死亡及時補(bǔ)充。

1.4 模型成功的判斷標(biāo)準(zhǔn)

表1 不同時間點(diǎn)各組大鼠腦內(nèi)NGF陽性細(xì)胞數(shù)比較

表2 不同時間點(diǎn)各組大鼠腦內(nèi)BDNF表達(dá)

腦出血組術(shù)后可見明顯的肢體癱瘓，沿針道冠狀切面切開腦組織可見血腫形成，正常組和假手術(shù)組肢體活動自如。

1.5 標(biāo)本制取與組織學(xué)檢查

各組大鼠在不同時間點(diǎn)給予水合氯醛腹腔麻醉（0.035mL/kg），開胸，將37℃ 0.9%氯化鈉水溶液緩慢推入動物的體循環(huán)，持續(xù)3～5min（200mL）至右心房流出的液體基本無色，將灌流液換4%多聚甲醛磷酸緩沖液，取大腦組織固定于4%多聚甲醛24h，石蠟包埋組織學(xué)觀察。

1.6 免疫組織化學(xué)染色法

嚴(yán)格按照說明書要求，①常規(guī)脫蠟至水。②3%H2O2室溫20min滅活內(nèi)源性酶。③高壓修復(fù)抗原。④滴加封閉液20min。⑤加NGF、BDNF多克隆抗體4℃過夜。⑥滴加生物素化山羊抗兔二抗IgG 20min。⑦SABC 37℃反應(yīng)30min，⑧DAB顯色⑨蘇木素復(fù)染，脫水，透明，封片，顯微鏡觀察結(jié)果。

1.7 記數(shù)方法及陽性結(jié)果判定

隨機(jī)選取大鼠腦內(nèi)陽性細(xì)胞區(qū)域5個不同視野，記錄陽性細(xì)胞數(shù)。

1.8 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用SPSS16.0軟件行單因素方差分析和t檢驗(yàn)，P＜0.05為統(tǒng)計學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié) 果

2.1 NGF在腦出血大鼠腦內(nèi)表達(dá)的變化規(guī)律

在正常組和假手術(shù)組中可見少量的NGF陽性細(xì)胞，主要位于大腦皮質(zhì)及海馬部位，并在各時間點(diǎn)無明顯的變化。在腦出血組中，6h時NGF在血腫周圍已經(jīng)出現(xiàn)表達(dá)增強(qiáng)，于24h達(dá)高峰，在以后的時間點(diǎn)逐漸下降。從陽性細(xì)胞的形態(tài)來看，大部分為神經(jīng)元細(xì)胞，胞體較大，形態(tài)較規(guī)則，免疫陽性顆粒位于胞體和突起，呈均勻的棕黃色顆粒。小部分是小膠質(zhì)細(xì)胞，呈圓形或橢圓形，形態(tài)不規(guī)則，陽性顆粒位于細(xì)胞胞質(zhì)。正常組陽性細(xì)胞數(shù)為（4.0±1.26），假手術(shù)組及腦出血組陽性細(xì)胞數(shù)，見表1。

2.2 BDNF在腦出血大鼠腦內(nèi)表達(dá)的變化規(guī)律

免疫陽性顆粒主要位于神經(jīng)元細(xì)胞核和和細(xì)胞質(zhì)，以胞漿邊緣顯色較深，正常組和假手術(shù)組可在大腦皮質(zhì)及海馬部位發(fā)現(xiàn)BDNF少量表達(dá)。在腦出血組12h時，BDNF在血腫周圍表達(dá)增加，陽性細(xì)胞密度增加（P＜0.05），于24h達(dá)高峰，7d仍有一定程度的高表達(dá)，與正常組和假手術(shù)組比較差異具有顯著性（P＜0.05）。正常組陽性細(xì)胞數(shù)為（3.17±1.16），見表2。

3 討 論

3.1 NGF變化特點(diǎn)分析

NGF廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，對神經(jīng)系統(tǒng)有重要的神經(jīng)營養(yǎng)和促神經(jīng)突觸生長的生物學(xué)效應(yīng)。大量研究表明，NGF對ICH血腫周圍損傷神經(jīng)元具有保護(hù)和修復(fù)作用[2]。其神經(jīng)保護(hù)可能機(jī)制為：①NGF 通過增加過氧化氫酶、超氧化物歧化酶等自由基清除劑的活性，減輕腦出血后引起的神經(jīng)元的損傷[3]。②抗細(xì)胞凋亡[4]。③維持細(xì)胞內(nèi)Ca2+的穩(wěn)態(tài)[5]。我們的實(shí)驗(yàn)動態(tài)觀察了NGF在腦出血大鼠腦組織中表達(dá)的變化，在正常組和假手術(shù)中，發(fā)現(xiàn)少量的NGF陽性細(xì)胞，腦出血組6h，在血腫周圍開始出現(xiàn)大量深棕色的陽性細(xì)胞，24h達(dá)高峰，48h已經(jīng)開始下降，與正常組和假手術(shù)比較差異有顯著性，說明在腦出血后，腦損傷后可誘導(dǎo)NGF一過性表達(dá)增高，從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，但是時間短暫，含量低微。

3.2 BDNF變化特點(diǎn)分析

BDNF是成年大鼠腦內(nèi)分布最廣泛的神經(jīng)營養(yǎng)因子，不僅調(diào)節(jié)神經(jīng)元的生長、分化及軸突的功能，而且也是神經(jīng)元維持生存和執(zhí)行正常功能所必需的。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后，BDNF可為受損神經(jīng)元提供營養(yǎng)而促進(jìn)其存活與修復(fù)[6]。許多實(shí)驗(yàn)證實(shí)，BDNF通過激活其受體TrkB，阻斷胞內(nèi)損傷因子對蛋白激酶C的失活，以防止神經(jīng)元發(fā)生變性、死亡[7]。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：12h時，BDNF在血腫周圍表達(dá)增加（P＜0.05），于24h達(dá)高峰，與假手術(shù)組及正常組差異有統(tǒng)計學(xué)意義，其可能的機(jī)制為腦出血后腦損傷激發(fā)自我保護(hù)機(jī)制，誘導(dǎo)BDNF蛋白表達(dá)及分泌增加，保護(hù)受損神經(jīng)元。傳統(tǒng)的觀念認(rèn)為，BDNF是在靶器官合成，通過逆轉(zhuǎn)運(yùn)到神經(jīng)元，發(fā)揮營養(yǎng)和維持存活作用的一種蛋白。Schutte等[8]研究發(fā)現(xiàn)，BDNF以出胞的形式分泌到細(xì)胞外基質(zhì)，對臨近的神經(jīng)細(xì)胞發(fā)揮營養(yǎng)作用。我們的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在正常組和假手術(shù)組中，BDMF的陽性細(xì)胞主要分布于大腦皮質(zhì)及海馬部位，腦出血后，皮質(zhì)及海馬部位均表達(dá)增高，陽性細(xì)胞數(shù)數(shù)量增加，我們推測可能BDNF蛋白在皮質(zhì)、海馬及血腫周圍的神經(jīng)元或膠質(zhì)細(xì)胞中合成，逆轉(zhuǎn)運(yùn)到達(dá)血腫周圍，通過自分泌或旁分泌的方式發(fā)揮營養(yǎng)作用，這與以往的實(shí)驗(yàn)結(jié)論不同，但確切的機(jī)制尚不清楚。

另外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，NGF和BDNF在空間分布上具有重疊性，時間變化上具有一定的相似性，是否兩者在發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用中具有交叉或協(xié)同作用，有待于進(jìn)一步研究。

綜上所述，腦出血后腦損傷可激發(fā)內(nèi)源性神經(jīng)保護(hù)機(jī)制，引起NGF及BDNF蛋白表達(dá)增加，但其作用有限，時間短暫。

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