多重PCR檢測食源金黃色葡萄球菌nuc、blaZ和mecA基因方法的建立與應(yīng)用*

劉書亮,劉冬香,賈仁勇,韓新鋒

金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,簡稱Sa)是引起食物中毒的重要致病菌,也是造成人和動物感染的主要病原菌之一。食源耐甲氧西林Sa(Methicillin-resistant S.aureus,MRSA)的污染研究成為世界各國研究的熱點。我國養(yǎng)殖業(yè)中廣泛應(yīng)用抗菌藥,也引起廣泛關(guān)注。

由于傳統(tǒng)的細(xì)菌分離鑒定、毒素檢測以及耐藥性測定費時費力,敏感性差。PCR方法快速敏感,在Sa的種屬基因鑒定及耐藥性分析中已有不少報告〔1-3〕。由于基因的表達(dá)受多種因素調(diào)控,基因檢測與表型存在一定差異〔4〕。本研究旨在建立快速鑒定食源Sa(耐熱核酸酶基因,nuc)及檢測Sa對β-內(nèi)酰胺類藥物耐藥性(β-內(nèi)酰胺酶基因,blaZ;甲氧西林耐藥基因,mecA)的多重PCR方法,分析食源MRSA污染情況,同時比較表型與基因型的一致性和差異性。現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 標(biāo)準(zhǔn)菌株:金黃色葡萄球菌ATCC33591為M RSA 陽性菌、ATCC29213為β-內(nèi)酰胺酶陽性Sa,由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院吳聰明博士惠贈;試驗菌株:分離鑒定于成都等地市的豬源、牛源、雞源動物性食品樣品中的 79 株 Sa〔5〕,由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品微生物實驗室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基 Mueller-Hinton(M-H)肉湯:購自杭州微生物試劑有限公司;氨芐青霉素:由寶生物工程(大連)公司提供;LB培養(yǎng)基、氨芐青霉素平板(Amp-LB)自配。

1.1.3 抗生素 青霉素類:青霉素G(PEN)、氨芐西林(AMP)、苯唑西林(OXA)、阿莫西林-克拉維酸(AMC);頭孢類:先鋒唑啉(CFZ)、頭孢曲松(CTX)、頭孢噻呋(CEF);均為原藥粉,由課題組統(tǒng)一提供。

1.1.4 分子生物學(xué)試劑 溶菌酶、2×Taq PCR Master Mix、DL2000 DNA Marker、GoldviewTMDNA染料均購自天根生化科技有限公司;DNA凝膠回收試劑盒、pMD18-T Simple Vector和感受態(tài)細(xì)胞E.coli JM109、dNT Pmixture、Taq聚合酶等購自寶生物工程(大連)有限公司;其它化學(xué)試劑均為分析純。

1.1.5 主要儀器 MyCyclerPCR儀(Bio-RAD),PowerPac Basic電泳儀及水平電泳槽(Bio-RAD),凝膠成像系統(tǒng)(Bio-RAD),Milli-Q Gradient超純水系統(tǒng)(Millipore公司),B4i-BR4i冷凍離心機(jī)(Thermo)等。

1.2 方法

1.2.1 藥敏試驗 按照美國臨床實驗標(biāo)準(zhǔn)委員會(NCCLS)(2007)進(jìn)行藥液配制,采用NCCLS推薦的肉湯微量稀釋法對Sa進(jìn)行β-內(nèi)酰胺類抗生素(組合)藥敏試驗,并進(jìn)行結(jié)果判定。

1.2.2 產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶試驗 按照趙旺勝等〔6〕的碘量法進(jìn)行,以ATCC 29213為β-內(nèi)酰胺酶陽性對照。

1.2.3 多重PCR方法建立

1.2.3.1 引物設(shè)計 根據(jù)GenBank中登錄的Sa的nuc、blaZ、mecA 基因序列,利用Primer 5.0軟件設(shè)計3對特異性引物(表 1),由 invitrogen公司合成。

表1 引物序列和產(chǎn)物大小Table 1 Primer Sequences and product sizes

1.2.3.2 模板制備 將分純的Sa試驗菌株和標(biāo)準(zhǔn)菌株分別接種于 LB肉湯,37℃震蕩培養(yǎng)過夜。取2mL培養(yǎng)物于12 000r/min離心2min,收集菌體。根據(jù)唐俊妮〔7〕報道方法提取DNA。

1.2.3.3 單一基因PCR擴(kuò)增 根據(jù)所設(shè)計的引物,在相同條件下以標(biāo)準(zhǔn)菌 ATCC33591和ATCC29213的 DNA為模板進(jìn)行 nuc、blaZ和mecA的單一基因 PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系(25μL)的組成 :2 ×Master Mix 12.5μL、Primer 1(10μ mol/L)1μL、Primer 2(10μ mol/L)1μL、Template 2μL、ddH2O 8.5μL。經(jīng)預(yù)實驗獲得的 PCR反應(yīng)程序為:94℃預(yù)變性5min,94℃變性45s,57℃退火50s,72℃延伸1.5min,進(jìn)行30個循環(huán),72℃延伸10min,PCR產(chǎn)物于4℃保存。

1.2.3.4 多重PCR條件優(yōu)化 根據(jù)單一基因PCR建立多重PCR方法,反應(yīng)體系仍25μL,其中2×Master Mix 12.5μL,Template 3μL,加入引物后,補 ddH2O至 25μL。逐一對引物濃度、退火溫度、延伸時間和溫度、循環(huán)次數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。

1.2.3.5 瓊脂糖凝膠電泳 PCR產(chǎn)物經(jīng)1%(0.5×TBE)瓊脂糖凝膠電泳后,觀察并成像。

1.2.3.6 擴(kuò)增產(chǎn)物測序鑒定:回收的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行T克隆后由invitrogen公司測序,并進(jìn)行序列分析。

1.2.4 多重PCR方法檢測試驗菌株 對食源79株Sa提取的DNA進(jìn)行多重PCR檢測,并與表型比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單一基因PCR結(jié)果 通過優(yōu)化,退火溫度為57℃時,各引物的單一基因PCR擴(kuò)增均能獲得較好結(jié)果(見圖1),單一基因片段大小與預(yù)期結(jié)果相符。

圖1 mecA、blaZ、nuc單一基因 PCR電泳結(jié)果Fig.1 PCR products of MecA,blaZ,nuc gene after gel electrophoresis

2.2 多重PCR條件優(yōu)化 標(biāo)準(zhǔn)菌ATCC33591同時含有nuc、blaZ、mecA 3個基因,以該菌的基因組DNA為模板進(jìn)行多重PCR條件優(yōu)化。

2.2.1 引物優(yōu)化結(jié)果 根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果,3對引物等比例混合后,在引物應(yīng)用濃度均為0.4μ mol/L條件下的擴(kuò)增結(jié)果表明,長片段產(chǎn)物相對較弱,因此,對引物組合nuc/blaZ/mecA設(shè)了8個應(yīng)用濃度梯度,結(jié)果 0.2/0.2/0.4μ mol/L,0.2/0.2/0.6μ mol/L,0.4/0.4/0.8μ mol/L條件下均特異擴(kuò)增出了3個目的片段,且條帶較清晰,見圖2,因此選擇這3個濃度做進(jìn)一步的PCR條件優(yōu)化。

2.2.2 退火溫度優(yōu)化結(jié)果 根據(jù)引物優(yōu)化結(jié)果,其它條件不變,比較在 54℃、55℃、56℃、57℃退火溫度和3種引物濃度梯度下的擴(kuò)增結(jié)果,最終確定引物組合nuc/blaZ/mecA的濃度是0.2/0.2/0.4μ mol/L,退火溫度為56℃。退火溫度優(yōu)化結(jié)果見圖3。

2.2.3 延伸時間和溫度、循環(huán)次數(shù)的優(yōu)化結(jié)果 根據(jù)對72℃延伸1min、1.5min、2min和68℃延伸2min比較顯示,72℃延伸2min擴(kuò)增效果最佳,同時反應(yīng)循環(huán)次數(shù)優(yōu)化結(jié)果表明,35次循環(huán)優(yōu)越于30次循環(huán)反應(yīng)(見圖4)。因此,最佳的反應(yīng)程序是:94℃預(yù)變性5min后,94℃變性50s,56℃退火50s,72℃延伸2min,進(jìn)行35個循環(huán),最后以72℃延伸10min。

2.3 基因測序結(jié)果與相似性分析 以ATCC33591的DNA為模板,擴(kuò)增的nuc、blaZ、mecA單一基因產(chǎn)物序列分析表明,該菌株nuc、blaZ、mecA基因PCR產(chǎn)物測序分別得到長 229 bp、787 bp、1459 bp的片段,與設(shè)計大小完全符合;測得序列已在NCBI注冊,登錄號分別為 FJ809757、FJ809758、FJ810876,編碼氨基酸序列登錄號分別為ACO37595、ACO37596、ACO24928。采用 BLAST和DNA STAR MegAlign進(jìn)行基因比對分析。

圖4 延伸時間和溫度以及循環(huán)數(shù)優(yōu)化電泳結(jié)果Fig.4 PCR products with different extension times,temperatures and cycles after gel electrophoresis

ATCC33591的nuc基因(FJ809757)與登錄號EF529596.1(SA strain G8)、CP000730.1(SA subsp.aureus USA300_TCH1516)和EF529608.1(SA strain 2513)等的nuc基因序列有98.7%～100%的相似性,其ACO37595與上述Sa菌株的耐熱核酸酶的氨基酸序列的相似性高達(dá)98.7%～100%;而該基因與溶血葡萄球菌(S.haemolyticus)(NC_007168)、表皮葡萄球菌(S.epidermidis)(NC_004461)相似性和編碼相應(yīng)氨基酸序列(YP_253498.1和NP_764559.1)相似性均較低。

ATCC33591的blaZ基因(FJ809758)與登錄號AB245469.1(SA strain 80s-3)、AY917098.1(SA strain a53)、BX571856.1(SA strain MRSA252)、AJ302698.2(S.haemolyticus)、CP000028.1(S.epidermidis)、(S.intermedius,中間葡萄球菌)等的blaZ基因序列有98.5%～100%的相似性,其ACO37596與上述菌株的β-內(nèi)酰胺酶的氨基酸序列的相似性達(dá)97.7%～100%。

ATCC33591的mecA基因(FJ810876)與登錄號AB425824.1(SA strain JCSC6670)、AY271717.1(SA strain 2314)和CP000046.1(SA subsp.aureus COL)等mecA基因序列有99.7%以上的相似性,其ACO24928與上述菌株的PBP2a氨基酸序列的相似性也達(dá)99.2%以上。上述分析進(jìn)一步表明該方法正確。

2.4 多重PCR方法對試驗菌株檢測結(jié)果 采用建立的Sa nuc、blaZ、mecA基因三重 PCR方法,對供試的 79株 Sa進(jìn)行檢測,結(jié)果只有 58株(占73.42%)同時擴(kuò)增出nuc和blaZ基因,另有19株(占24.68%)只能擴(kuò)增出nuc基因,所有菌株均未擴(kuò)增出mecA基因,即無MRSA檢出。該方法能鑒定出77株Sa,鑒定率為97.47%(77/79)。部分菌株的多重PCR檢測結(jié)果,見圖5。

圖5 部分Sa菌株多重PCR檢測結(jié)果Fig.5 Multiplex PCR products of partial Sa isolation strains after gel electrophoresis

2.5 PCR檢測結(jié)果與表型比較 供試79株菌的菌落在顯色平板上顯粉紅或紫紅色且凝固酶陽性,但只有77株菌nuc基因擴(kuò)增陽性。試驗菌株基因型與表型符合率為97.47%。

由表2可知,β-內(nèi)酰胺酶陽性、blaZ 陽性和β-內(nèi)酰胺酶陰性、blaZ陰性的符合率為60.76%(48/79);對PEN、AMP同時耐藥、blaZ陽性和對PEN、AMP同時敏感、blaZ陰性的菌株占75.95%(60/79),對青霉素類(PEN、AMP)敏感性分析結(jié)果、β-內(nèi)酰胺酶試驗結(jié)果和blaZ擴(kuò)增結(jié)果同時符合的菌株占49.37%(39/79)。

表2 blaZ擴(kuò)增結(jié)果與β-內(nèi)酰胺酶試驗和對青霉素類敏感性結(jié)果對比分析Table 2 Comparison of blaZ gene detection using PCR,β lactamase assay and penicillins sensitivity test

將blaZ擴(kuò)增結(jié)果與菌株對青霉素類藥物的最低抑菌濃度(MICs)進(jìn)行對比分析,見表3。隨著MICs增加blaZ陽性和blaZ陰性菌株數(shù)之間并沒有什么相關(guān)性,無論MICs值大小,總有blaZ陽性和blaZ陰性菌株同時存在,blaZ陽性菌株數(shù)總是多于blaZ陰性菌株數(shù)。

藥敏試驗結(jié)果表明,食源79株Sa對測試的3種頭孢菌素均為100%敏感。測定對苯唑西林的敏感性即是代替甲氧西林,苯唑西林藥敏結(jié)果顯示菌株的 MICs值在0.03～0.25μ g/mL之間,沒有檢出苯唑西林耐藥的Sa,而79株Sa的mecA PCR檢測結(jié)果均為陰性,表明無MRSA檢出。因此,耐甲氧西林的基因與表型檢測結(jié)果完全相符。

3 討 論

3.1 檢測Sa的nuc、blaZ和mecA基因多重PCR方法的建立 引物設(shè)計是PCR實驗成功的關(guān)鍵。本實驗設(shè)計的同時擴(kuò)增nuc、blaZ和mecA基因的3對引物具有特異性。由于三個目標(biāo)片段的大小差異較大,一定程度上增加了實驗的難度,但通過對擴(kuò)增體系和擴(kuò)增參數(shù)的逐一優(yōu)化,成功建立了擴(kuò)增nuc、blaZ和mecA基因的三重PCR方法。該方法簡便、快捷、準(zhǔn)確,不僅能快速鑒定Sa,也能檢測MRSA,更主要的是還能一定程度闡明Sa對β-內(nèi)酰胺類抗生素的耐藥機(jī)制,這點優(yōu)越于其他多重 PCR方法〔1-3〕。正由于擴(kuò)增的 nuc、blaZ和mecA 基因目標(biāo)片段的大小差異較大,還有望結(jié)合其它耐藥基因、腸毒素基因進(jìn)行多基因的同步擴(kuò)增。

表3 不同MICs值條件下的blaZ陽性/blaZ陰性菌株數(shù)比較Table 3 Comparison of blaZ positive or negative strains at different MICs

3.2 Sa的nuc、blaZ和mecA基因檢測結(jié)果與表型結(jié)果分析 Sa產(chǎn)生耐熱核酸酶使菌落在含有甲苯胺藍(lán)的顯色平板上顯紅色,這是Sa重要的表型特征。Sa 的 nuc 基因〔8-9〕、血漿凝固酶(coa)基因〔10〕、16S rRNA〔11〕和耐藥輔助(femA)基因〔12〕常被作為種特異性基因,尤其是 nuc〔8-9〕、f emA 基因〔12〕具有很高的種特異性。本實驗也表明nuc基因與其表型具有較高的符合率為97.47%。

耐藥性的產(chǎn)生與攜帶耐藥相關(guān)基因有關(guān)。Sa對β-內(nèi)酰胺類耐藥主要有兩種機(jī)制:一是產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶,破壞β-內(nèi)酰胺環(huán)從而對青霉素類耐藥,由blaZ基因編碼;二是耐甲氧西林的菌株獲得了mecA基因,編碼新的青霉素結(jié)合蛋白 PBP2a〔13〕。目前臨床報道的90%Sa都產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶,但Desj Simeoni報道豬肉生產(chǎn)鏈中分離的葡萄球菌中有63.6%菌株為blaZ陽性〔14〕。本實驗中blaZ擴(kuò)增陽性率為73.42%,相對較高。β-內(nèi)酰胺酶試驗結(jié)果和對青霉素類的敏感性結(jié)果與blaZ擴(kuò)增結(jié)果的符合率分別為60.76%和75.95%,而三個試驗結(jié)果(β-內(nèi)酰胺酶實驗,對青霉素類敏感性和blaZ擴(kuò)增)同時符合率為49.37%。耐青霉素G、氨芐西林的菌株中也有blaZ擴(kuò)增陰性的菌株,并且通過與MICs進(jìn)行比較分析,不同 MICs值下幾乎都有blaZ陽性和blaZ陰性菌株,且blaZ陽性菌株占優(yōu)勢,敏感性與blaZ擴(kuò)增結(jié)果并沒有必然相關(guān)性。這些結(jié)果也說明耐藥表型分析和基因型分析各有側(cè)重點,因而存在一定差異。其原因可能是,本試驗菌株來源于食品源所受到的藥物選擇壓力低,不同于臨床分離菌株,對青霉素耐藥的機(jī)制可能沒被藥物激活,抗性蛋白表達(dá)量低。文獻(xiàn)表明對Sa耐青霉素G的表型和基因型比較,采用頭孢硝噻吩直接測定β-內(nèi)酰胺酶比瓊脂平板稀釋法藥敏試驗?zāi)芨玫念A(yù)測blaZ基因的存在,在處于臨界MICs的Sa對青霉素的耐藥性判定中,可能瓊脂稀釋法中使用的耐藥折點值太高,因為使用這種方法40%攜帶blaZ基因的菌株被列為敏感株〔15〕。也有可能對于表型測試陽性而blaZ陰性的菌株還有其它的耐藥機(jī)制(如生物膜、主動外排)起了作用。

mecA是甲氧西林耐藥決定子,79株食源Sa的mecA基因檢測和表型耐藥監(jiān)測結(jié)果均為陰性,符合率100%,也表明此次檢測動物性食品源Sa中無MRSA。目前動物性食品中MRSA的擴(kuò)散傳播較少〔4,16〕,故產(chǎn)生 β-內(nèi)酰胺酶是對青霉素類耐藥的主要原因,本實驗結(jié)果與之一致。

目前,養(yǎng)殖業(yè)中仍存在濫用抗生素、食品中耐藥細(xì)菌危險性逐步增高,給人類健康造成較大危害,由于食源性Sa呈現(xiàn)出不一樣的耐藥特性,本研究為加強動物性食品源Sa尤其MRSA的耐藥性檢測和連續(xù)監(jiān)測提供了技術(shù)保障,掌握其發(fā)生變化趨勢,為食品源Sa的安全評價提供有力支持。

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