兔腦血吸蟲病腦基底動脈縫隙連接蛋白Cx37 mRNA的表達(dá)及其意義*

林雪群,萬麗丹,薛國勇,祝高春,楊 剛

腦血吸蟲病是人體感染血吸蟲后,血吸蟲侵犯到腦部血管,蟲卵的分泌和排泄產(chǎn)物通過血管內(nèi)皮細(xì)胞進入腦內(nèi),沉積在腦組織中,形成蟲卵肉芽腫、假性結(jié)核結(jié)節(jié)或瘢痕結(jié)節(jié),其毒素作用導(dǎo)致腦水腫、腦軟化,造成腦組織一系列病理改變〔1〕。腦血吸蟲病的病理機制一直是許多學(xué)者長期關(guān)注的問題,有學(xué)者認(rèn)為血吸蟲蟲卵激活內(nèi)皮細(xì)胞的機制除涉及到細(xì)胞內(nèi)信號的改變外〔2〕,還可能和內(nèi)皮細(xì)胞間的縫隙連接緊密相關(guān)。因此,我們研究和觀察腦血吸蟲病腦血管壁縫隙連接蛋白的表達(dá)和分布,為探查腦血吸蟲病的發(fā)病機理提供形態(tài)學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 兔腦血吸蟲病模型制作 New Zealand大白兔10只,2.0～2.5kg,雌雄不拘,1%戊巴比妥鈉(40mg/kg)行耳緣靜脈注射麻醉后,固定在立體定位儀上,暴露顱骨,在前囟前5 mm和右外側(cè)3 mm鉆一直徑為2 mm骨孔,在額極挑破腦膜,將內(nèi)徑0.1 mm的PE-10管向下向后沿皮層表面方向插入1 mm,管腔中可抽到清亮腦脊液,證明位于蛛網(wǎng)膜下腔,再將塑料管插入腦內(nèi)3mm深,可見管內(nèi)有腦脊液返流,通過塑料管向顱內(nèi)注射血吸蟲蟲卵懸液0.2mL(約含蟲卵5 000個),然后用502膠水封住骨孔,縫合頭皮,衛(wèi)生條件下飼養(yǎng)。

1.2 間接血凝抑制試驗(IHA)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)腦血吸蟲病模型實驗動物術(shù)后存活30d,在1%戊巴比妥鈉40mg/kg行耳緣靜脈注射麻醉下,抽血和腦脊液作間接血凝抑制試驗(IHA)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)驗證。

1.2.1 間接血凝抑制試驗(IHA) 按間接血凝抑制試驗試劑盒(江西省血吸蟲病防治研究所購置)說明書進行,具體操作如下:

在血凝板的第1孔至第8孔各加2%NRS 50μL(取pH7.6、0.01mol/LPBS 98 mL,滅能兔血清 2mL,于4℃冰箱保存即成2%NRS液),用移液器取待檢血清50μL,加第1孔混勻,并從中取出50μL加入第2孔混勻后取出50μL加入第3孔,同樣操作直到第8孔混勻后棄去50μL,然后每孔各加抗原 25μL,稀釋過程中嚴(yán)防吸頭的互相接觸和相鄰孔內(nèi)液體相互污染。振蕩1 min室溫下(15℃以上)靜置1.5～2h。觀察待檢血清各孔的凝集程度,以呈“++”凝集的被檢血清最大稀釋度為其血凝效價(血凝價)。血清的血凝價達(dá)到1∶16為免疫合格。

取陰性血清和陽性血清分別作陰性對照和陽性對照。

1.2.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)操作:按血吸蟲抗體ELISA檢測試劑盒(深圳市康百得生物科技有限公司購置)說明書操作,具體操作如下:抗原用包被液(0.2 mol/L Na2CO38 mL,0.2 mol/L NaHCO317 mL,加75 mL蒸餾水,調(diào)pH 至9.6)稀釋至10μ g/mL;以 100μL/孔量加入酶標(biāo)板孔中,置 4 ℃過夜;棄去孔內(nèi)的液體,同時用洗滌液(KH2PO4 0.2g,KCl 0.2g,Na2HPO4·12H2O 2.9g,NaCl 8.0g,Tween-20 0.5 mL,加蒸餾水至1 000 mL,pH7.2)洗3次,每次 5 min;每孔加 200μL封閉液(5%脫脂乳)4℃過夜;洗滌液洗3次;每孔加50μL不同稀釋度的待檢血清,同時設(shè)立陽性、陰性對照和空白對照;37℃孵育 1 h,洗滌,拍干;加H RP標(biāo)記的羊抗兔IgG,每孔50μL,37 ℃孵育 1 h,洗滌,拍干;加底物液,每孔加新鮮配制的底物使用液(OPD 5 mg,底物緩沖液 10 mL,30%H2O240μL)100μL,37 ℃10-30 min;以 2 mol/L H2SO450μL 終止反應(yīng)。

1.2.3 結(jié)果判斷 肉眼觀察:在白色背景下觀察各孔顯色情況,陰性對照無色,陽性對照呈明顯黃色,表示試驗有效。待檢孔無色表示該標(biāo)本為陰性,待檢孔呈黃色表示該標(biāo)本為陽性。酶標(biāo)儀測定:以空白對照調(diào)零用酶標(biāo)儀于450nm(620nm作參比波長)讀取OD值,待檢孔OD值大于陰性對照2.1倍者為陽性。

1.3 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法檢測腦血吸蟲病兔腦基底動脈Cx37 mRNA的表達(dá) 10只腦血吸蟲病模型兔作為實驗組;10只New Zealand大白兔作為對照組。各組實驗動物1%戊巴比妥鈉經(jīng)耳緣靜脈注射(50 mg/kg),麻醉后開顱取基底動脈血管組織,于冰浴的kerbs液中小心剝離其上粘附的蛛網(wǎng)膜,于液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.1 組織總RNA提取和逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 采用異硫氰酸胍一步法,取腦基底動脈血管組織100 mg標(biāo)本組織,加入預(yù)冷的 Trizol變性液1mL(洛陽華美生物工程公司購買),在玻璃勻漿器中冰上勻漿,靜置5 min,其余步驟嚴(yán)格按Trizol提取液說明書操作。所得總RNA溶解于無RNase水中。取部分總RNA用紫外分光光度計(Bankman USA DU-640型)進行定量和純度測定,用2%凝膠電泳檢查其完整性,其余-70℃保存待用。取總 RNA 5μL,在20μL體系中以Random hexamer perimr為引物,應(yīng)用AMV逆轉(zhuǎn)錄酶合成第1鏈cDNA。具體反應(yīng)體系為:總 RNA 5μL 與 ribonuclease 抑制劑 0.5μL,Random hexamer perimr 1μL,65℃,5 min。然后加入第1鏈緩沖液 5μL,ribonuclease抑制劑0.5μL,dNTP混合液2μL,AMV逆轉(zhuǎn)錄酶1μL,37℃水浴1h,90℃水浴5 min。反應(yīng)完后,迅速冰上冷卻,室溫高速離心5 s,-20℃保存。

1.3.2 PCR擴增反應(yīng) 取5μL逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板,依次加入下述組分:10×PCR反應(yīng)緩沖液5μL,dNTP混合液(2.5mmol/L)4μL,Taq DNA聚合酶1μL,Cx37 上、下游引物各 0.5μL,β-actin 上、下游引物各0.5μL,加無菌雙蒸水至50μL,在PCR 合成儀中進行。實驗所用引物序列為:Cx37:(antisense)5′-GAC TGG GGC TTC CTG GAG AAG-3′,(sense)5′-GCC ACC GAG ATC T TG GCC ATC-3′,可擴增長413bp 的 cDNA 片段;β-actin:5′-CAT CTC TTG CTC GAA GTC CA 3′,5′-ATC ATG T T T GAG ACC T TC AAC A 3′,可擴增長308 bp的cDNA片段。開始用92℃2 min,然后循環(huán)參數(shù):92℃50 s,550C 45 s,72℃60 s,共30個循環(huán),最后一個循環(huán)在62℃延伸7 min。

1.3.3 擴增產(chǎn)物的電泳分析 10μL PCR產(chǎn)物經(jīng)2.0%瓊脂糖凝膠中電泳分離,紫外透射分析儀觀察后照相,凝膠圖象分析系統(tǒng)對PCR的產(chǎn)物進行定量。以Cx37 mRNA擴增帶的光密度與β-actin擴增帶的光密度的比值代表細(xì)胞中mRNA的表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 以統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS 10.0進行方差分析及Student-Newan-Keuls法分析處理。

2 結(jié) 果

2.1 血和腦脊液間接血凝抑制試驗(IHA)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA) 檢測結(jié)果見表1和表2。血和腦脊液IHA和ELISA檢測結(jié)果表明腦血吸蟲病模型建立良好。

表1 血清免疫學(xué)檢查Table 1 Immunological assay for serum

表2 腦脊液免疫學(xué)檢查Table 2 Immunological assay for cerebral spinal fluid

2.2 RT-PCR法檢測腦血吸蟲病腦基底動脈Cx37 mRNA表達(dá) 所有樣品的OD260nm/OD280nm值均在1.8～2.0之間,表明總RNA純度較高,沒有蛋白質(zhì)的殘余,質(zhì)量可靠?？?RNA變性瓊脂糖電泳結(jié)果顯示28S、18S、5S條帶均較為清楚(見圖1),提示RNA提取較為完整、無降解。RT-PCR結(jié)果顯示,正常兔腦基底動脈表達(dá) Cx37 mRNA與 β-actin mRNA的比值為0.607±0.071,腦血吸蟲病兔腦基底動脈Cx37 mRNA表達(dá)比值為1.370±0.095,與正常組比較增加了近3倍,經(jīng)統(tǒng)計學(xué)檢驗具有顯著性差異(P＜0.05)(見圖2,3)。

圖1 兔腦血吸蟲病腦基底動脈Cx37總RNA凝膠電泳圖Fig.1 Gel electrophoresis results of Cx37 total RNA in basilar artery of rabbits cerebral schistosomiasis

3 討 論

血吸蟲侵入體內(nèi)經(jīng)血循環(huán)感染到肺、肝臟和腸道組織引起血吸蟲病,已被許多學(xué)者所公認(rèn)〔3〕;關(guān)于肺血吸蟲、肝血吸蟲的動物模型早已被許多學(xué)者研究所應(yīng)用。但是,由于腦血吸蟲病的動物模型一直難以制作,從而使腦血吸蟲病發(fā)病機理的研究受到極大的限制,尤其是蟲卵究竟經(jīng)過什么途徑到達(dá)顱內(nèi)?又是怎樣經(jīng)過腦動脈沉積于腦組織這一關(guān)鍵而又重要的問題一直備受人們的關(guān)注。

根據(jù)縫隙連接的生物特性及其作用,我們設(shè)想縫隙連接可能參與了腦血吸蟲病的病理發(fā)生,在內(nèi)皮細(xì)胞間隔的縫隙連接中,蟲卵及其分泌物與內(nèi)皮細(xì)胞的相互接觸是否可能調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮縫隙連接蛋白的上調(diào),不僅可以影響宿主的免疫反應(yīng),而且可能涉及血管內(nèi)皮屏障的滲透性,從而使蟲卵及其分泌物經(jīng)血管內(nèi)皮細(xì)胞溢出,沉積于腦組織而形成炎癥性肉芽腫,引發(fā)腦血吸蟲病。因此,從細(xì)胞和分子水平深入研究縫隙連接蛋白參與腦血吸蟲病的分子機制,探討血吸蟲卵沉積于腦組織的途徑和機理,探索腦動脈縫隙連接蛋白在腦血吸蟲病發(fā)病機理中的作用,為進一步探討腦血吸蟲病的防治措施有著重要的意義。

縫隙連接是由2個位于相鄰細(xì)胞膜上互相對應(yīng)的半通道(hemichannel)組成,中間相隔2 nm,每個半通道是由縫隙連接蛋白六聚體結(jié)構(gòu)圍繞一個水相通道排列而構(gòu)成連接小體(Connexon);連接小體中間的管道對接而聯(lián)通相鄰細(xì)胞胞漿形成GJ通道〔4〕。Cx基因家族編碼一大類膜蛋白,由許多成員組成,其中至少有12種Cx,但參與體內(nèi)血管壁細(xì)胞間GJ構(gòu)成的連接蛋白類型主要有三種〔5〕,它們分別為Cx37、Cx43和 Cx40;血管內(nèi)皮細(xì)胞以表達(dá)Cx37為主,平滑肌細(xì)胞以表達(dá)Cx43和Cx40為主。已有的研究〔6〕主要針對體內(nèi)較大的彈力血管組織的研究,如主動脈、腸系膜動脈等。體內(nèi)一些小動脈,如腦基底動脈等,對這些小動脈管壁上連接蛋白的表達(dá)和分布目前尚不清楚,尤其是在腦血吸蟲病病理情況下,血管內(nèi)皮細(xì)胞及胞間通透性的改變,可能涉及腦動脈管壁上縫隙連接蛋白的表達(dá)和分布發(fā)生變化。

我們通過觀察發(fā)現(xiàn),腦血吸蟲病兔腦基底動脈Cx37 mRNA表達(dá)較正常兔腦基底動脈Cx37 mRNA表達(dá)明顯升高,約是正常兔的3倍,可見腦血吸蟲病兔腦血管壁細(xì)胞的縫隙連接結(jié)構(gòu)的分布有其獨特性。GJ的主要功能是參與細(xì)胞間信息傳遞和細(xì)胞功能活動的協(xié)調(diào);參與細(xì)胞的分化、生長與發(fā)育;細(xì)胞可通過GJ向周圍細(xì)胞排出代謝產(chǎn)物,減少毒物對細(xì)胞的損害,細(xì)胞還可通過GJ向周圍細(xì)胞提供其所需的營養(yǎng)物質(zhì)〔7〕。實驗結(jié)果提示腦血吸蟲病兔腦基底動脈高表達(dá)的Cx37 mRNA,可能涉及腦血管細(xì)胞間信息傳遞和細(xì)胞功能活動的改變,涉及血管內(nèi)皮屏障的滲透性,從而使蟲卵及其分泌物便于經(jīng)血管內(nèi)皮細(xì)胞溢出,沉積于腦組織而誘發(fā)腦血吸蟲病。其確切的功能和和致病機制有待更深入的研究。

縫隙連接作為細(xì)胞進行信息交流的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ),參與腦血管組織的生理和病理過程。對腦血吸蟲病腦血管壁縫隙連接蛋白的深入研究,將有利于揭示縫隙連接蛋白和腦血吸蟲病之間的聯(lián)系,有利于闡明腦血吸蟲病的傳播途徑及發(fā)病機理,為進一步探討腦血吸蟲病的預(yù)防和治療措施提供形態(tài)學(xué)資料。

〔1〕蔣忠銘.腦血吸蟲病的M R診斷〔J〕.實用醫(yī)技雜志,2004,11(2):132-133

〔2〕T rottein F,Descamps L,Nutten S,et al.Schistosoma mansoni activates host microvascular endothelial cells to acquire an antiinflammatory phenotype〔J〕.Infection and Immunity,1999,67(7):3403-3409

〔3〕Hanna LS,Medhat AM,Abdel-Menem HA.Biochemical changes after subchronic and chronic interaction of Schistosoma mansoni infection in Swiss albino mice with two specific compounds〔J〕.J Egypt Soc Parasitol,2003,33(1):245-260

〔4〕Antonio DM,Virginia L.Gap junctions,homeostasis and injury〔J〕.J Cell Phy siol,2002,191:269-282

〔5〕Seul KH,Beyer EC.Mouse connexin 37 gene structure and promoter an lysis〔J〕.Biochem Biophys Acta,2000,1492(2):499-504

〔6〕Pollmann MA,Shao Q,Laird DW,et al.Connexin 43 mediated gap junctional communication enhances breast tumor cell diapedesis in culture outline〔J〕.Breast Cancer Research,2005,7:522-534

〔7〕Kurjiaka DT,Steele TD.Gap junction permeability is diminished in proliferating vascular smooth muscoe cells〔J〕.Am J Physiol,1998,275:1674-1682