一株纖維素降解細(xì)菌的篩選、鑒定及特性研究

隨著現(xiàn)代工業(yè)的發(fā)展、世界人口的增長(zhǎng)，化石能源對(duì)環(huán)境造成巨大危害，人類越來越意識(shí)到尋找清潔可再生能源的迫切性。來源于生物質(zhì)原料的燃料乙醇以其可再生性、無污染性、不引起溫室效應(yīng)等特點(diǎn)而被公認(rèn)為最有工業(yè)應(yīng)用前景的可再生能源之一，因而得到了廣泛的研究。

我國(guó)的纖維素資源非常豐富，僅農(nóng)作物秸稈，每年就達(dá)6～10億t[1]。近年來， 對(duì)秸稈類纖維素物質(zhì)的利用主要采用生物法， 即利用微生物將纖維素、半纖維素降解并轉(zhuǎn)化為菌體蛋白[2]，所以分離和篩選高效產(chǎn)酶的菌種顯得極其重要，但目前所篩選的高效纖維素降解菌多為真菌，生長(zhǎng)較慢，且菌體產(chǎn)色，不適于工業(yè)應(yīng)用。

作者在此篩選出一株可利用玉米種皮纖維作為底物、高效產(chǎn)纖維素酶的細(xì)菌，對(duì)擴(kuò)大纖維素降解菌種的篩選和應(yīng)用范圍具有重要意義。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料與試劑

檸檬葉樣品：自然界采集，用生理鹽水清洗，風(fēng)干后處理成小段，備用。

羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)溶液：稱取1 g CMC-Na，加入100 mL水，水浴加熱使溶解，再加入pH值5.0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液20 mL、水40 mL混勻，即得CMC-Na溶液。

DNS試劑參照文獻(xiàn)[3]配制。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 CMC-Na篩選培養(yǎng)基[4]

CMC-Na 10.0 g，尿素 1.0 g，KH2PO42.0 g， MgSO4·7H2O 0.5 g，CaCl20.5 g，蛋白胨1.0 g，瓊脂18.0 g，蒸餾水1000 mL，pH值為 5.0。

1.2.2 剛果紅分離篩選培養(yǎng)基[5，6]

KH2PO40.5 g，MgSO40.25 g，瓊脂18.0 g，明膠2.0 g， CMC-Na 2.0 g，剛果紅0.20 g，蒸餾水1000 mL，pH值為5.0。

1.2.3 產(chǎn)酶培養(yǎng)基

玉米皮20 g，KH2PO42 g，CaCl20.5 g，吐溫-80 2 mL，CoCl20.5 mg，蒸餾水1000 mL，pH值為5.0。

1.3 方法

1.3.1 菌種初篩

將處理好的檸檬葉樣品放到CMC-Na篩選培養(yǎng)基平板上，于36℃培養(yǎng)48 h，觀察菌落形態(tài)。

1.3.2 菌種復(fù)篩

將劃線分離得到的單個(gè)菌株富集培養(yǎng)后分別點(diǎn)種到剛果紅分離篩選培養(yǎng)基平板上，于30℃培養(yǎng)3 d，觀察有無透明圈。

1.3.3 菌種鑒定

1.3.3.1 菌種基因組DNA PCR模板的制備

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌株1.5 mL，于13 000 r·min-1離心1 min，去上清，雙蒸水洗滌1次；再于13 000 r·min-1離心1 min，沉淀懸浮于200 μLTE緩沖溶液中， 沸水煮10 min；冰浴10 min，再于13 000 r·min-1離心5 min，將上清液儲(chǔ)存于-20℃，取1 μL用于PCR反應(yīng)[7]。

1.3.3.2 PCR反應(yīng)條件

PCR反應(yīng)條件[4]：94℃ 5 min；94℃ 50 s，52℃ 50 s，72℃ 1 min，32個(gè)循環(huán)；72℃ 8 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，選擇理想的PCR產(chǎn)物送至北京索萊寶生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行DNA測(cè)序。

1.4 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

用電子天平準(zhǔn)確稱取0.250 g 葡萄糖，用蒸餾水溶解定容至250 mL，即得1.0 mg·mL-1的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別取上述標(biāo)準(zhǔn)溶液5 mL、10 mL、15 mL、20 mL、25 mL于50 mL容量瓶中，稀釋定容；再分別取2 mL配制好的溶液，加入1.5 mL DNS試劑于沸水中加熱15 min顯色后，以蒸餾水作參比，在554 nm處測(cè)定吸光度。以吸光度為橫坐標(biāo)、葡萄糖濃度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程[3]。

1.5 酶活測(cè)定

取0.5 mL稀釋10倍的酶液，加入1.5 mL 0.625%羥甲基纖維素(CMC)溶液，于50℃保溫30 min，加入2 mL 10%的氫氧化鈉溶液終止反應(yīng)，再加入3 mL DNS試劑，于沸水中煮15 min，在554 nm處測(cè)吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線或線性回歸方程計(jì)算酶活[3]。

2 結(jié)果與討論

2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 透明圈與菌落形態(tài)(圖2)

圖2 透明圈照片(a)及菌落形態(tài)(b)

由圖2可以看出,在剛果紅-CMC培養(yǎng)基上的菌落周圍形成明顯的透明圈，證明菌落周圍的纖維素被降解。

2.3 菌種鑒定

根據(jù)16S rDNA序列比較推測(cè)細(xì)菌間進(jìn)化關(guān)系，進(jìn)而對(duì)未知細(xì)菌進(jìn)行鑒定和檢測(cè)[1]。經(jīng)NCBI上BLAST (http://www.ncbi.nim.nih.gov) 同源性檢索和分析，發(fā)現(xiàn)菌株與Bacillussubtilis的16S rDNA序列有98%的同源性,因此初步確定其屬于枯草芽孢桿菌，命名為L(zhǎng)13。

2.4 溫度對(duì)CMCase酶活的影響

在裝有100 mL產(chǎn)酶培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中加入5%處在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的L13菌液，于pH值5.0、150 r·min-1條件下振蕩培養(yǎng)，每組3個(gè)平行，考察溫度對(duì)產(chǎn)酶的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3 溫度對(duì)CMCase酶活的影響

由圖3可以看出,菌株L13在50℃時(shí)產(chǎn)酶效果最好,CMCase 酶活最高達(dá)到4.02 U·mL-1。這可能是因?yàn)闇囟冗^高或過低，均不利于酶的積累，從而影響產(chǎn)酶效果。

2.5 pH值對(duì)CMCase酶活的影響

在裝有100 mL產(chǎn)酶培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中加入5%處在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的L13 菌液，于50℃、150 r·min-1條件下振蕩培養(yǎng)，每組3個(gè)平行，考察pH值對(duì)產(chǎn)酶的影響，結(jié)果如圖4所示。

圖4 pH值對(duì)CMCase 酶活的影響

由圖4可以看出,菌株L13在pH值5.0時(shí)產(chǎn)酶效果最好，CMCase酶活最高達(dá)到5.21 U·mL-1。這可能是因?yàn)椋嵝缘沫h(huán)境是菌種的適宜生長(zhǎng)條件。

3 結(jié)論

(1)應(yīng)用PCR擴(kuò)增、16S rDNA測(cè)序及序列分析等技術(shù)，初步鑒定纖維素降解細(xì)菌為枯草芽孢桿菌。

(2)在50℃、pH值為5.0的條件下，菌株L13產(chǎn)酶效果最好，酶活最高達(dá)到5.21 U· mL-1。說明枯草芽孢桿菌對(duì)纖維素有較好降解能力，在處理農(nóng)村大量秸稈和城市有機(jī)廢棄物方面有非常廣闊的應(yīng)用前景。

參考文獻(xiàn)：

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[2] 李日強(qiáng)，王愛英，孔令冬.一株纖維素分解菌的分離選育[J].山西大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2006，29(3):317-320.

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[4] 安明泉.纖維素降解菌的篩選分離與產(chǎn)纖維素酶的特性研究[D]. 北京：中國(guó)石油大學(xué)(北京)，2008.

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