動脈溶栓聯(lián)合自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞局部注射治療股骨頭缺血壞死臨床研究

陳啟忠 史躍 王安明 朱麗麗 劉軍權(quán) 丁凱 葛紀(jì) 高從敬

隨著微創(chuàng)介入技術(shù)的不斷開展，局部動脈內(nèi)溶栓已成為一種趨勢，為股骨頭缺血壞死的治療開辟了一條新的途徑。近年來，干細(xì)胞的移植和組織工程是最引人關(guān)注的課題，自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植在骨壞死的治療領(lǐng)域發(fā)揮重要的作用。我院介入治療中心自2007年5月以來，采用動脈溶栓聯(lián)合自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞局部注射介入方法治療早期外傷性股骨頭缺血壞死11例，取得了滿意的療效，報道如下。

1 臨床資料

1.1 一般資料 2007年5月～2008年10月，共治療11例I～I(xiàn)I期外傷性股骨頭缺血壞死病人，11例患者中10人有少量飲酒，無大量應(yīng)用激素史。其中單側(cè)9例，雙側(cè)2例，男10例，女1例，年齡26～38歲，平均年齡31歲。病史3個月～1年，全部病例均有治療前、后血管造影片及CT、MRI片，診斷明確。所有患者治療之前均明確告知本治療的優(yōu)點(diǎn)或不足，患者或家屬簽署知情同意書，并報醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)方法 抽取患者骨髓20ml，肝素抗凝，用間充質(zhì)干細(xì)胞分離液分離單個核細(xì)胞，吸取單個核細(xì)胞，用pH7.4PBS洗三次，將細(xì)胞懸浮于15%胎牛血清的DMEM F12的培養(yǎng)基中，置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。三天后棄懸浮細(xì)胞繼續(xù)用上述培養(yǎng)基培養(yǎng)貼壁細(xì)胞，細(xì)胞生長至底面積的70%時用EDTA胰酶消化貼壁細(xì)胞后傳代培養(yǎng)。標(biāo)本從采集到分離時間不超過1h。顯微鏡下每天觀察細(xì)胞生長及增殖情況。分別取各代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSC)，置于有小玻片的6孔板中，待細(xì)胞80%～90%貼壁生長后取出，用10%中性甲醛固定，蘇木精染色，顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。經(jīng)3～5代培養(yǎng)后MSC即可達(dá)到治療數(shù)量。細(xì)胞培養(yǎng)板更換含有10～7mmoL/L、地塞米松、10mmol/Lβ-磷酸甘油、0.05mmol/L維生素C和15%胎牛血清的成骨分化誘導(dǎo)液，培養(yǎng)3周，每周換液2次，分別于誘導(dǎo)的第7，14天取出部分細(xì)胞固定，觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化并進(jìn)行組織學(xué)染色。收集體外向成骨細(xì)胞誘導(dǎo)第14天的MSC制備成20ml細(xì)胞懸液供患者治療使用，MSC數(shù)量約為1×107～1×108個(圖1)。

1.3 造影方法 常規(guī)下采用seldinger技術(shù)，經(jīng)皮-股動脈穿刺，用COOK或Cordis 5.0 F Cobra導(dǎo)管常規(guī)行患側(cè)股動脈、髂內(nèi)動脈數(shù)字減影血管造影(digital subtraction angiography,DSA)。以6ml/s注射速度，6幀/s連續(xù)采集圖像，根據(jù)DSA造影表現(xiàn)，了解旋股內(nèi)、旋股外動脈、閉孔動脈的起源及股骨頭血供。根據(jù)造影結(jié)果，行旋股內(nèi)動脈、旋股外動脈及閉孔動脈超選擇插管，著重注意旋股內(nèi)動脈的超選，本組11例患者股骨頭均有旋股內(nèi)動脈、閉孔動脈及其分支血管供養(yǎng)，旋股外動脈主要供養(yǎng)大粗隆及股骨脛區(qū)域。

1.4 治療方法 將5.0F Cobra導(dǎo)管選擇至旋股內(nèi)動脈、閉孔動脈，灌注脲激酶40萬U，罌栗鹼50mg，低分子右旋糖酐40ml或復(fù)方丹參40ml。1周后在DSA引導(dǎo)下經(jīng)皮關(guān)節(jié)腔和股骨頭壞死區(qū)穿刺，注射第14天的MSC細(xì)胞懸液5ml，然后將穿刺針退至關(guān)節(jié)腔注射10～15ml。間隔2周、4周再進(jìn)行第二、三次介入治療，3次為一療程。觀察股骨頭血管數(shù)量及粗細(xì)變化，血管密度改變及股骨頭造影染色情況。囑患者臥床或患肢避免負(fù)重2～3個月，在此期間服用鈣劑、改善微循環(huán)及活血藥物，同時進(jìn)行功能鍛煉。

1.5 骨質(zhì)診斷標(biāo)準(zhǔn)及分期[1]參照Ficat和Arlet對股骨頭缺血壞死平片診斷標(biāo)準(zhǔn)及分期。I期：有髖關(guān)節(jié)僵硬和疼痛，X線沒有特殊征象。II期：X線片上有骨重建跡象，而整個股骨頭外形及關(guān)節(jié)間隙正常，根據(jù)骨質(zhì)變化又分為3型。A型(疏松型)：負(fù)重區(qū)有彌漫性骨質(zhì)疏松；B型(硬化型)：在股骨頭圓韌帶區(qū)有囊性變，周圍清晰，而頭呈一致性硬化改變；C型(混合型)：有硬化和透光區(qū)存在。III期：股骨頭連續(xù)性斷裂，頭頂端有塌陷或變扁，與髖臼接觸處明顯，出現(xiàn)新月征，死骨呈圓錐狀下陷，軟骨下骨塌陷或股骨頭變扁。IV期：股骨頭進(jìn)一步壞死，關(guān)節(jié)間隙變窄，并呈典型的骨關(guān)節(jié)炎改變。

1.6 關(guān)節(jié)活動參照標(biāo)準(zhǔn)[2]0級：髖關(guān)節(jié)屈伸、外展、內(nèi)收、外旋、內(nèi)旋度數(shù)總和為260°～320°為正常；1級：髖關(guān)節(jié)屈伸、外展、內(nèi)收、外旋、內(nèi)旋度數(shù)總和為260°～190°，功能稍受限，生活基本自理；2級：為190°～160°，功能部分受限；3級：為160°～130°，功能明顯受限；4級：為130°，功能受限。

1.7 觀察方法及主要觀察指標(biāo)[3]觀察方法：疼痛程度、骨關(guān)節(jié)功能、數(shù)字減影血管造影、X射線片骨形態(tài)變化有改善，可視為干細(xì)胞移植治療有效。主要觀察指標(biāo)：①臨床指標(biāo)：干細(xì)胞移植后隨訪觀察患者髖關(guān)節(jié)疼痛程度、疼痛性質(zhì)及疼痛時間變化、行走距離及步態(tài)變化、髖關(guān)節(jié)外展與內(nèi)旋功能變化。②數(shù)字減影血造影術(shù)及X線攝片檢查指標(biāo)：干細(xì)胞移植后6個月行股骨頭供血動脈造影術(shù)，觀察血管新生及股骨頭供血動脈充盈情況；每6個月行髖關(guān)節(jié)X線片檢查，觀察股骨頭區(qū)骨質(zhì)變化。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 治療前后兩組療效的組間比較采用x2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 數(shù)字減影血管造影表現(xiàn) 11例中缺血型7例；淤血型3例；1例為混合型。經(jīng)過1個療程后，對比同一時相DSA血管造影圖像，股骨頭頸區(qū)域血管數(shù)量及粗細(xì)變化，表現(xiàn)為狹窄閉塞血管再通或明顯出現(xiàn)側(cè)枝循環(huán)血管，同區(qū)域血管明顯增多、增粗并延長，靜脈回流通暢，股骨頭血管染色區(qū)域明顯增大(圖2)。

2.2 治療前后關(guān)節(jié)活動度變化見表1。

2.3 骨質(zhì)變化的影像學(xué)表現(xiàn) 動脈灌注體外向成骨細(xì)胞誘導(dǎo)第14天的MSC，治療1個療程后，經(jīng)6～24個月的隨訪觀察，早期(3～6個月)骨囊變區(qū)骨質(zhì)增生硬化不明顯，后期(6～18個月)骨囊變區(qū)縮小，骨質(zhì)增生硬化明顯，股骨頭壞死區(qū)域逐漸縮小(圖3)，有效率100%。

2.4 髖部疼痛改變

動脈灌注MSC經(jīng)過1個療程3次治療后，11例患者疼痛均消失，關(guān)節(jié)功能恢復(fù)正常，有效率100%。

表1 治療前、后關(guān)節(jié)活動度

圖1 瑞吉氏染色×1000，培養(yǎng)第14天的MSC細(xì)胞(黑箭)

圖2 a治療前，股骨頭壞死區(qū)血管分支稀、細(xì)、少或呈落葉后的柳樹枝狀(黑箭)b治療后，股骨頭滋養(yǎng)動脈分支管徑增粗，新生血管增多(黑箭)

圖3 a治療前，MRI顯示左側(cè)股骨頭壞死(黑箭)b治療后，MRI顯示左側(cè)股骨頭壞死區(qū)明顯縮小(黑箭)

3 討論

3.1 股骨頭缺血壞死的病因、病理及發(fā)病機(jī)制 股骨頭缺血壞死是一種常見的骨科疾病，它嚴(yán)重危害、摧殘人類健康，輕則使人致殘，喪失勞動和生活自理能力，重則使人癱瘓而抱病終身[4]。引起ANFH的病因很多，其病因及發(fā)病機(jī)制尚不十分清楚，主要是由于創(chuàng)傷、應(yīng)用激素、過度飲酒、結(jié)締組織疾病等各種原因?qū)е鹿晒穷^局部滋養(yǎng)血管損傷,進(jìn)而使骨質(zhì)缺血、變性、壞死、骨小梁斷裂及股骨頭塌陷,發(fā)生髖關(guān)節(jié)功能障礙。股骨頭無菌性壞死的病理改變?yōu)閇5]：①骨髓細(xì)胞和骨壞死。②壞死骨組織吸收與早期修復(fù)。③壞死骨組織的修復(fù)與重建。④股骨頭塌陷，髖關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎。股骨頭壞死的發(fā)病機(jī)制[4]：由于髖關(guān)節(jié)是人體最大的負(fù)重關(guān)節(jié)，且剪力大，活動小范圍大，血供相對薄弱，血管吻合支少，解剖特點(diǎn)易于造成缺血。頭部形態(tài)特殊，與頸部骨髓距離狹長，周圍由致密骨包繞。在遇到外傷、激素或酒精等誘因，使股骨頭滋養(yǎng)動脈損傷，使血管床受壓、閉塞，動脈壓增高，靜脈回流受阻，使骨的血液循環(huán)障礙，影響骨的代謝產(chǎn)物及時排出，并形成惡性循環(huán)引起股骨頭缺血壞死。

3.2 股骨頭缺血性壞死的臨床表現(xiàn) 臨床表現(xiàn)為[3,5]：①關(guān)節(jié)疼痛。早期出現(xiàn)髖關(guān)節(jié)周圍及膝關(guān)節(jié)疼痛，疼痛可為間隙性，向大腿內(nèi)側(cè)放射，負(fù)重外展及伸直髖關(guān)節(jié)時加重。②下肢功能障礙。隨著病情發(fā)展，髖關(guān)節(jié)屈曲、內(nèi)收、外展功能受限。早期為肌肉痙攣引起，繼而因關(guān)節(jié)攣縮，髖關(guān)節(jié)活動范圍縮小，向各個方向活動受到限制，逐漸出現(xiàn)髖關(guān)節(jié)僵直，髖傾斜，腰椎生理曲度加大，出現(xiàn)下肢功能障礙。③跛行。由于股骨頭及關(guān)節(jié)囊內(nèi)壓增高，患者出現(xiàn)跛行。

3.3 MSC治療股骨頭缺血性壞死的臨床意義 研究發(fā)現(xiàn)，股骨頭缺血壞死的發(fā)病可能與成骨細(xì)胞及骨髓基質(zhì)細(xì)胞的功能下降有關(guān)[6,7,8]。因此，在動脈溶栓的基礎(chǔ)上，經(jīng)皮患側(cè)股骨頭穿刺局部注射MSC懸液，有助于壞死區(qū)骨質(zhì)的修復(fù)。通過對11例早期股骨頭缺血壞死患者經(jīng)過1個療程的治療，發(fā)現(xiàn)股骨頭壞死區(qū)表現(xiàn)為狹窄閉塞血管再通或明顯出現(xiàn)側(cè)支循環(huán)血管，同區(qū)域血管明顯增多、增粗并延長，靜脈回流通暢，股骨頭血管染色區(qū)域明顯增大；壞死股骨頭囊變區(qū)縮小，骨質(zhì)增生硬化明顯，股骨頭壞死區(qū)域逐漸縮小。

3.4 間充質(zhì)干細(xì)胞治療早期股骨頭缺血壞死的前景 隨著干細(xì)胞工程技術(shù)逐漸興起和發(fā)展, 使干細(xì)胞治療股骨頭缺血性壞死成為了研究的熱點(diǎn)，特別是對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞研究的不斷深入，對股骨頭缺血壞死的發(fā)病機(jī)理有了新的認(rèn)識，在治療方法上也有了新的發(fā)展，給股骨頭缺血壞死帶來了新的希望。多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)及臨床研究證實(shí)骨髓干細(xì)胞體外分離培養(yǎng)后, 在一定的誘導(dǎo)條件下, 可以向成骨細(xì)胞方向分化[9,10]。Hernigou[11]和Ganji[12]分別使用自體骨髓細(xì)胞修復(fù)股骨頭壞死病灶清除后的缺損, 均取得良好的療效。楊曉鳳等[3]使用外周血及骨髓干細(xì)胞移植治療缺血性疾病, 證實(shí)干細(xì)胞形成新生血管直接改善血供。可見通過骨髓干細(xì)胞動脈灌注治療股骨頭缺血壞死，既有利于股骨頭血液供應(yīng)的恢復(fù)，又能提高局部成骨能力，從而促進(jìn)壞死骨的修復(fù)，對早期股骨頭壞死的治療是有利的，目前多與其它療法合并應(yīng)用[13]。經(jīng)動脈灌注溶栓及擴(kuò)張血管藥物，改善股骨頭區(qū)微循環(huán)，有利于MSC對壞死區(qū)股骨頭的修復(fù)。

通過動脈溶栓聯(lián)合MSC局部注射介入治療外傷性早期股骨頭缺血性壞死，結(jié)果顯示，有效率100%。對III～I(xiàn)V期可緩解疼痛、改善關(guān)節(jié)功能、延緩股骨頭置換時間、阻止病變進(jìn)展有較好的作用。但長期療效尚有待更多病例臨床觀察來驗(yàn)證。

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