胃癌常見(jiàn)中醫(yī)證型與CDX2、LN-R和MMP-9陽(yáng)性表達(dá)的相關(guān)性研究

田君才 張莉 焦丹 戴偉平 李昌吉 張桂霞

胃癌在我國(guó)惡性腫瘤死因順位中位居第一位，占全部腫瘤死亡總數(shù)的四分之一。浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤致死的主要原因，因此惡性腫瘤的浸潤(rùn)與轉(zhuǎn)移成為腫瘤學(xué)研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)之一。基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)是一系列生理情況下可降解細(xì)胞外基質(zhì)及基底膜的內(nèi)肽酶總稱(chēng)，其中明膠酶(MMP-9)可分解基底膜Ⅳ型膠原，作為專(zhuān)一性降基膜的酶越來(lái)越引起關(guān)注。層粘連蛋白(LM)是一種基底膜糖蛋白，通過(guò)與受體(LM-R)結(jié)合能調(diào)節(jié)細(xì)胞的粘附、擴(kuò)散和遷徙。惡性腫瘤細(xì)胞表面含有大量LM-R，使瘤細(xì)胞更易與基底膜粘附，在腫瘤的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移過(guò)程中起重要作用。尾側(cè)同源框相關(guān)基因2(CDX 2)抗體在人體組織中有明顯的腸道特異性，在結(jié)腸、直腸為主的的消化道及相關(guān)腫瘤中高度表達(dá)，低表達(dá)在其他腸道，但胃中無(wú)表達(dá)。

1 臨床資料

1.1 一般資料 收集酒泉市人民醫(yī)院病理科(2002～2003年行手術(shù)治療)胃癌病例，詳細(xì)翻閱病歷檔案，依據(jù)1978年全國(guó)第一屆胃癌學(xué)術(shù)會(huì)議北京市胃癌協(xié)作組制定的6型分法對(duì)患者進(jìn)行中醫(yī)辨證分型，選取其中符合瘀毒內(nèi)阻型、肝胃不和型和脾胃虛寒型的三種證型共53例，全部獲病理學(xué)確診。觀(guān)察其病理組織形態(tài)特點(diǎn)(男41例，占選取胃癌病例的77.4%，女12例，占選取胃癌病例的22.6%，平均年齡(57.2±8.5)歲，男：女=3.4：1)，Laurén分型：腸型29例，彌漫型24例。TNM分期：Ⅰ期11例，Ⅱ期11例，Ⅲ期22例，Ⅳ期9例。按細(xì)胞分化程度：高分化14例，中分化20例，低分化15例。無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移17例，有轉(zhuǎn)移36例，選取其中蠟塊保存較好的胃癌手術(shù)切除標(biāo)本行免疫組織化學(xué)檢測(cè)。所有標(biāo)本4μm連續(xù)切片，分別作HE染色和免疫組織化學(xué)染色。

1.2 實(shí)驗(yàn)步驟及方法 查閱病例檔案，統(tǒng)計(jì)并收集病例，選取病例，辨證分型，4um連續(xù)切片，HE染色，進(jìn)行W HO和Lau ren分型，免疫組化染色，觀(guān)察分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

1.3 實(shí)驗(yàn)步驟 所有標(biāo)本按照常規(guī)病理技術(shù)處理，10%的福爾馬林固定，石蠟包埋，4um石蠟切片，常規(guī)HE染色，觀(guān)察胃粘膜的組織病理形態(tài)。

1.4 免疫組織化學(xué)染色 用EliVision法，觀(guān)察CDX 2、MMP-9和LM-R蛋白在胃癌中的表達(dá)情況。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)果判斷 陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn)用PBS代替一抗，余同，以此結(jié)果為陰性對(duì)照。陽(yáng)性對(duì)照采用邁新生物提供的陽(yáng)性對(duì)照片作為陽(yáng)性對(duì)照。其中CDX 2陽(yáng)性染色主要定位于細(xì)胞核，呈棕黃色顆粒，也有部分位于細(xì)胞漿；MMP-9陽(yáng)性表達(dá)部位主要位于胞漿，呈棕黃色或棕褐色顆粒；LM-R陽(yáng)性表達(dá)部位主要位于細(xì)胞膜，少數(shù)細(xì)胞質(zhì)也有表達(dá)，呈黃色顆粒。見(jiàn)圖1～3。

2.2 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)均采用SPSS13.0軟件應(yīng)用x2test，2-sided Fisher’s test，Spearm an’s rank correlation，配對(duì)的癌組織、癌旁組織采用Coch ran’s Q test。其中P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 研究結(jié)果

3.1 在肝胃不和、瘀毒內(nèi)阻、脾胃虛寒三種證型胃癌中CDX2、LM-R及MMP-9的表達(dá)情況分別見(jiàn)表1～表3。

經(jīng)x2檢驗(yàn)結(jié)果顯示CDX2在此三種不同的中醫(yī)證型中的表達(dá)無(wú)明顯差異性(P值均＞0.05)。

LM-R在肝胃不和型中的表達(dá)明顯高于瘀毒內(nèi)阻型(P＜0.05)，在肝胃不和型中的表達(dá)明顯高于在脾胃虛寒型中的表達(dá)(P＜0.05)，而在瘀毒內(nèi)阻型與脾胃虛寒型中的表達(dá)沒(méi)有顯著差異(P＞0.05)。

表1 胃癌中醫(yī)證型與CDX 2表達(dá)[n(%)]

表2 胃癌中醫(yī)證型與LM-R表達(dá)[n(%)]

表3 胃癌中醫(yī)證型與MMP-9表達(dá)[n(%)]

表4 CDX 2、LM-R和MMP-9蛋白之間表達(dá)的免疫組化結(jié)果

圖1 MMP-9陽(yáng)性×400 圖2 CDX 2陽(yáng)性×400

圖3 LM-R陽(yáng)性×400

MM P-9在肝胃不和型中的表達(dá)明顯高于瘀毒內(nèi)阻型(P=0.001＜0.05)，在脾胃虛寒型中的表達(dá)明顯高于瘀毒內(nèi)阻型(P=0.002＜0.05)，而在肝胃不和型與脾胃虛寒型中的表達(dá)沒(méi)有顯著差異(P=1＞0.05)。

3.2 CDX 2、LM-R和MMP-9蛋白之間表達(dá)的免疫組化結(jié)果 經(jīng)Pearson相關(guān)分析、x2檢驗(yàn)，CDX 2表達(dá)與LM-R或者M(jìn)MP-9表達(dá)水平之間無(wú)相關(guān)性(P＞0.05)；LM-R與MMP-9表達(dá)水平之間呈現(xiàn)顯著相關(guān)性(P＜0.05)。

4 結(jié)論

4.1 CDX 2、LM-R和MMP-9三者在胃癌及其配對(duì)正常癌旁組織中的陽(yáng)性表達(dá)率均存在顯著差異，表明以上三種基因陽(yáng)性表達(dá)與胃癌發(fā)生相關(guān)。

4.2 MMP-9在TNM分期中Ⅰ、Ⅱ期中的陽(yáng)性表達(dá)率明顯低于Ⅲ、Ⅳ期中的陽(yáng)性表達(dá)率。LM-R在TNM分期中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期中的陽(yáng)性表達(dá)率明顯低于Ⅳ期中的陽(yáng)性表達(dá)率。

4.3 MM P-9與LM-R在胃癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率呈現(xiàn)明顯正相關(guān)；而CDX 2與LM-R及MMP-9之間無(wú)相關(guān)性。

4.4 CDX 2在肝胃不和、瘀毒內(nèi)阻和脾胃虛寒三種證型胃癌中的表達(dá)無(wú)明顯差異性；LM-R和MM P-9在不同證型的胃癌的表達(dá)均有顯著差異，可作為胃癌辨證分型的輔助參考指標(biāo)。

5 討論

傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)結(jié)合現(xiàn)代醫(yī)學(xué)共同發(fā)展是當(dāng)前中醫(yī)學(xué)產(chǎn)生突破的一個(gè)方向。王氏等分析總結(jié)胃癌中醫(yī)辨證，認(rèn)為中醫(yī)證型確有其病理學(xué)基礎(chǔ)，它反映了胃癌的不同時(shí)期及不同程度，同時(shí)也給判斷病情，推測(cè)預(yù)后，指導(dǎo)治療(包括外科手術(shù)治療)提供了必要的理論依據(jù)[1]。郭氏研究慢性胃炎、消化性潰瘍、食管癌、胃癌1000例辨證分型與胃鏡圖像關(guān)系進(jìn)行了探討，認(rèn)為根據(jù)中醫(yī)辨證，結(jié)合胃鏡圖像檢查，可將上述疾病分為：肝胃氣滯、氣滯血瘀、脾胃虛寒、濕熱中阻、寒熱錯(cuò)雜五型，可能為中西醫(yī)結(jié)合診治消化系統(tǒng)疾病提供了較為規(guī)范化的客觀(guān)依據(jù)[2]。周冬枝等[3]從基因及蛋白表達(dá)不同角度著手，用半定量方法研究表明：隨著脾虛癥狀積分升高，p53，Bcl-2蛋白表達(dá)水平呈遞增趨勢(shì)，脾虛癥狀積分與p53，Bcl-2蛋白表達(dá)水平分別呈正相關(guān)，而B(niǎo)cl-2蛋白的表達(dá)水平隨著脾虛癥狀積分升高有遞減趨勢(shì)。說(shuō)明脾虛證的發(fā)生發(fā)展與p53，Bcl-2蛋白表達(dá)升高有關(guān)，進(jìn)一步證明基因表達(dá)與證的物質(zhì)基礎(chǔ)有關(guān)，p53，Bcl-2基因是胃癌脾虛證的相關(guān)基因。

本課題研究發(fā)現(xiàn)：MMP-9在3種證型中的表達(dá)為脾胃虛寒型＞肝胃不和型＞瘀毒內(nèi)阻型，其中脾胃虛寒型、肝胃不和型與瘀毒內(nèi)阻型有顯著性差異(P＜0.05)；LM-R在3種證型中的表達(dá)為肝胃不和型＞脾胃虛寒型＞瘀毒內(nèi)阻型，其中肝胃不和型與瘀毒內(nèi)阻型、脾胃虛寒型均有顯著性差異(P＜0.05)；CDX 2在3種證型中的表達(dá)為脾胃虛寒型＞肝胃不和型＞瘀毒內(nèi)阻型，各證型間無(wú)顯著性差異，但已有組間差異的趨勢(shì)。由于各目的基因在轉(zhuǎn)移的不同步驟發(fā)揮作用，結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果，提示同一基因在不同證型中發(fā)揮的作用不同，不同證型的轉(zhuǎn)移機(jī)制存在著一定的差異。而肝胃不和型中各基因的表達(dá)為MM P-9＞LM-R＞CDX 2；脾胃虛寒型中各基因的表達(dá)為MM P-9＞CDX 2＞LM-R；瘀毒內(nèi)阻型中各基因的表達(dá)為CDX 2＞MMP-9＞LM-R；不同證型3種基因的表達(dá)情況既有相同之處，又存在一定差異。提示我們：目的基因在m RNA水平表達(dá)的差異可能是形成不同證型的內(nèi)在物質(zhì)基礎(chǔ)之一。

[1]王安峰,劉斌,趙玉華,等.中晚期胃癌中醫(yī)辨證分型與組織病理學(xué)分型的關(guān)系及療效觀(guān)察[J].中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合外科雜志,2000,6(3):165.

[2]郭森仁,黃皓春,陳峻偉.胃鏡像與常見(jiàn)上消化道疾病辨證關(guān)系初探[J].北京中醫(yī),1994(5):16.

[3]周冬枝,昊蘇冬,劉永惠,等.胃癌中醫(yī)證型與p53,bc1-2,bax基因蛋白表達(dá)關(guān)系的研究[J].北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2003,26(2):26.