高糖對(duì)體外培養(yǎng)的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞CD147表達(dá)影響

文海榮,吳雅臻,李小萌

(1.吉林大學(xué)第二醫(yī)院眼科醫(yī)院,吉林長(zhǎng)春130041;2.東北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院)

CD147是一種分子量為50-60 kD的高度糖基化的單次跨膜糖蛋白,在眼角膜上皮、Müller細(xì)胞表面、視網(wǎng)膜色素上皮(human retinal pigment epithelium cell,RPE)和光感器細(xì)胞上均有表達(dá),尤其在RPE中有高水平的表達(dá)[1]。CD147參與機(jī)體不同的病理生理過(guò)程,如機(jī)體的炎癥反應(yīng),細(xì)胞-細(xì)胞或細(xì)胞-基質(zhì)的粘附,刺激成纖維細(xì)胞分泌基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs),導(dǎo)致基底膜和細(xì)胞間質(zhì)成分降解等。本研究通過(guò)觀察高糖條件下培養(yǎng)的RPE中CD147的表達(dá)變化,為糖尿病視網(wǎng)膜病變(proliferative diabetic retinopathy,PDR)的發(fā)病機(jī)制研究提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 低糖DMEM(含5.56 mmol/L葡萄糖)及高糖DMEM(含25mmol/L葡萄糖),FBS胎牛血清(美國(guó)GIBCO公司);Trypsin胰酶Trypsin胰酶粉(Sigma),CD147兔抗人一抗(中杉金橋),Cy3羊抗兔二抗(Sigma)。人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(中山大學(xué)細(xì)胞中心)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 RPE細(xì)胞培養(yǎng)與處理 將RPE細(xì)胞于完全培養(yǎng)基(DMEM中加入10%胎牛血清,1‰雙抗),置于37℃5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞鋪滿瓶底80%左右時(shí),用0.25%胰酶消化。在6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中鋪4個(gè)蓋玻片,以2×105個(gè)/ml接種,100 μ l/孔。其中兩個(gè)孔加入1 ml高糖完全培養(yǎng)基,另外兩孔加入1 ml低糖完全培養(yǎng)基。將細(xì)胞混勻,用槍頭輕輕壓實(shí)鋪在12孔板中的玻璃片,以防止氣泡存留。將6孔板、放入37℃5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中,待細(xì)胞長(zhǎng)至80%-90%,做免疫熒光檢測(cè)。

1.2.2 免疫熒光檢測(cè)CD147蛋白在RPE細(xì)胞中的定位 吸去培養(yǎng)基,500 μ l/孔預(yù)冷PBS洗細(xì)胞,吸出。10%甲醛固定液 500 μ l/孔,搖床放置30分鐘。600 μ l/孔 PBS 洗三次 ,10 min/次 。0.1%TritonX-100 500 μ l/孔,搖床放置 5 min。600 μ l/孔 PBS 洗三次,10min/次。2%BSA-PBS 500 μ l/孔 ,搖床放置封閉90分鐘。600 μ l/孔PBS洗三次,10 min/次。加CD147一抗(兔抗人)抗體:1%BSA=1∶2 000,500 μ l/孔,4度過(guò)夜(12小時(shí)),600 μ l/孔PBS洗三次,10 min/次。避光加二抗Cy3(羊抗兔),抗體:1%BSA=1∶1 000,300 μ l/孔 ,搖床放置 30 分鐘 。600 μ l/孔 PBS 洗三次,10 min/次。封片液封片,鏡檢。

1.2.3 Western blot檢測(cè)CD147蛋白在RPE細(xì)胞中的表達(dá) 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞加入全細(xì)胞裂解液200 μ L,吹打裂解后,將裂解液置于4℃,12 000 r/min離心15 min,取上清液。定量樣本加入6×樣品緩沖液,行10%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離。SDS-PAGE結(jié)束后,將凝膠與PVDF轉(zhuǎn)印膜一起按電轉(zhuǎn)移裝置說(shuō)明書要求安裝并放入電泳槽中,加電轉(zhuǎn)液在80 mA電流轉(zhuǎn)移4 h。轉(zhuǎn)膜后,脫脂奶粉封閉,一抗用封閉液以1∶1 000濃度稀釋,按0.1 ml/cm2加到PVDF膜上,4℃過(guò)夜,孵育10 h。二抗為辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔IgG,加到PVDF膜上,室溫反應(yīng)2 h。ECL法化學(xué)發(fā)光,X線底片曝光顯影。β-actin為內(nèi)參。

2 結(jié)果

2.1 免疫熒光檢測(cè)CD147在RPE細(xì)胞上的分布CD147蛋白在RPE細(xì)胞中高表達(dá)。在低糖條件下,CD147主要集中在細(xì)胞核中,一部分位于細(xì)胞質(zhì)中(圖1)。在高糖條件下,CD147主要分布于細(xì)胞膜上,一部分位于細(xì)胞質(zhì)中,細(xì)胞核中的CD147蛋白很少(圖2)。

2.2 Western blot檢測(cè)CD147在RPE細(xì)胞上表達(dá)量 CD147蛋白在RPE細(xì)胞上有表達(dá)。高糖條件下RPE細(xì)胞上CD147蛋白的表達(dá)量明顯高于低糖條件下RPE細(xì)胞上的CD147蛋白(圖3)。

圖1 低糖條件下CD147蛋白在RPE細(xì)胞中的分布

圖2 高糖條件下CD147蛋白在RPE細(xì)胞中的分布

圖3 不同培養(yǎng)條件下CD147蛋白在RPE細(xì)胞上的表達(dá)量變化

3 討論

CD147又稱基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)因子,屬于免疫球蛋白超家族成員,在體內(nèi)分布非常廣泛,參與各種不同的生理過(guò)程并具有多種不同的生理功能。近幾年對(duì)CD147的研究主要集中在腫瘤疾病中,發(fā)現(xiàn)在大多數(shù)腫瘤疾病中CD147可促進(jìn)細(xì)胞的異常增生,并通過(guò)上調(diào)MMPs的表達(dá),促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。且CD147的表達(dá)水平與腫瘤的惡性度正相關(guān)[2]。CD147還可與整合素作用影響細(xì)胞基質(zhì)構(gòu)建[3]。在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎發(fā)病過(guò)程中,CD147可同過(guò)上調(diào)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的表達(dá)促進(jìn)的新生血管生成[4]。近來(lái)一些對(duì)于鼠RPE細(xì)胞上CD147的研究顯示,CD147可能介導(dǎo)正常感光細(xì)胞與膠質(zhì)細(xì)胞間的相互作用,與多聚單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白一起參與RPE和Müller細(xì)胞的漿膜轉(zhuǎn)運(yùn)、能量代謝[5]。

本研究結(jié)果顯示CD147蛋白在RPE細(xì)胞上存在表達(dá),同時(shí)存在于胞膜、胞漿和胞核中。在低糖培養(yǎng)條件下,CD147蛋白主要集中在細(xì)胞核中,一部分位于細(xì)胞漿;在高糖培養(yǎng)條件下,RPE細(xì)胞變長(zhǎng),CD147在RPE中的定位發(fā)生變化,由細(xì)胞核向細(xì)胞膜轉(zhuǎn)移,主要存在于細(xì)胞膜上,部分位于細(xì)胞漿。由于CD147是一種膜蛋白,主要通過(guò)糖基化的程度和方式不同,與其他蛋白相互作用發(fā)揮作用,因此我們推測(cè)當(dāng)環(huán)境中的葡萄糖濃度增加時(shí),CD147蛋白由細(xì)胞內(nèi)向細(xì)胞膜轉(zhuǎn)移,在細(xì)胞膜上的功能性蛋白增多發(fā)揮更強(qiáng)的生物學(xué)作用。Western-blot結(jié)果證實(shí),在高糖條件下CD147蛋白在RPE細(xì)胞中的表達(dá)量較低糖條件下明顯增加。再次提示CD147蛋白可能參與了高糖條件下RPE細(xì)胞的生物學(xué)特性的變化。

綜上我們可以推測(cè),在高糖條件下,CD147蛋白的修飾及表達(dá)變化,促進(jìn)RPE細(xì)胞的生物學(xué)特性的變化。這為我們研究糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)病機(jī)制提供了新的思路。

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