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    不同pH值條件下的絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

    2010-05-29 05:36:58彭繼明張佑紅
    武漢工程大學(xué)學(xué)報 2010年3期
    關(guān)鍵詞:茚三酮絲氨酸容量瓶

    彭繼明,張佑紅,徐 鵬,陳 林,馬 靜,危 威

    (武漢工程大學(xué)化工與制藥學(xué)院,綠色化工過程省部共建教育部重點實驗室,湖北 武漢 430074)

    0 引 言

    絲氨酸是人體中物質(zhì)代謝、生理活動、抵抗疾病必不可少的物質(zhì),在醫(yī)藥、食品、化妝品中有廣泛的應(yīng)用.絲氨酸含量的變化不僅可以為疾病的診斷、治療效果的觀察提供有價值的數(shù)據(jù)及資料,還是檢驗食品和化妝品是否合格的重要標(biāo)準(zhǔn),因此準(zhǔn)確測定絲氨酸含量具有極其重要的意義[1-5].測定絲氨酸量的方法有高效液相色譜法[6],氨基酸自動分析儀法[7-10],但二者需要較貴重的儀器設(shè)備且操作步驟復(fù)雜.已有大量的文獻(xiàn)報道,用分光光度法測定絲氨酸的含量,準(zhǔn)確率極高,與氨基酸自動分析儀檢測的含量的誤差在2%以內(nèi)[11].因此,氨基酸與茚三酮反應(yīng)在臨床檢驗、衛(wèi)生分析、食品工業(yè)和藥品檢驗等方面被廣泛采用,在蛋白質(zhì)合成和結(jié)構(gòu)鑒定中也常用來完成定性和定量測定[12-14].該反應(yīng)受多種因素的影響,主要有:反應(yīng)pH值、顯色劑含量、反應(yīng)時間、溫度、氨基酸種類等[15-18].關(guān)于反應(yīng)的最佳pH值的報道有很多,但觀點并不一致,從pH值4.0~9.0為最佳均有報道[19-20].

    在實際應(yīng)用的反應(yīng)體系中,基于反應(yīng)體系的特點,準(zhǔn)確測定絲氨酸的含量時,不宜加入過多的酸或堿調(diào)節(jié)pH值(因為加入酸或堿引起的體積變化,會導(dǎo)致絲氨酸濃度發(fā)生較大變化).研究絲氨酸磷脂制備體系中的絲氨酸含量時,體系存在以下幾個特點:a.絲氨酸與茚三酮反應(yīng),在處于文獻(xiàn)報道的緩沖溶液最佳pH值時,磷脂酶D的活性有可能喪失(當(dāng)pH為4.0~7.0時,磷脂酶D有活性.b.在酸性、堿性和中性環(huán)境中,絲氨酸與茚三酮反應(yīng)的機理不同,生成的有色物質(zhì)也不相同.c.為了研究酶的動力學(xué),反應(yīng)在pH值分別為4.5,5.0,5.5,6.0,7.0的緩沖液中進(jìn)行,緩沖液的pH值難以調(diào)至文獻(xiàn)報道的絲氨酸與茚三酮反應(yīng)的pH值.d.實驗過程中測定最佳反應(yīng)時間和酶量時,需連續(xù)取樣,每次取樣量為0.2 mL(取樣量較小),加入酸堿調(diào)節(jié)pH值至最佳,容易引起較大的誤差.為了獲得磷脂酶D在絲氨酸磷脂制備體系中的最佳pH值,需要得到絲氨酸在幾種不同pH值下的標(biāo)準(zhǔn)曲線.

    本實驗采用茚三酮顯色法,測定了絲氨酸與茚三酮反應(yīng)的最佳時間和相對用量,并確定絲氨酸在pH值分別為4.5,5.0和6.0時的絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線.

    1 實驗部分

    1.1 試劑與儀器

    試劑:卵磷脂(優(yōu)級純),絲氨酸(優(yōu)級純), 南京奧多福尼生物科技有限公司生產(chǎn);磷脂酶D(優(yōu)級純),Streptomyces Sp.Glycerophospholipid specific; 茚三酮 (分析純),氯化亞錫 (分析純), 國藥集團化學(xué)有限公司生產(chǎn); 其他試劑均為分析純試劑儀器:HH-S型恒溫水浴鍋,上海東璽制冷儀器有限公司生產(chǎn);Mk3酶標(biāo)儀, BCD-251FBNW超低溫冰箱,上海熱電儀器有限公司生產(chǎn);PB-10pH測定儀,北京賽多利斯儀器有限公司生產(chǎn);AL204型電子天平,梅特勒—托利多儀器(上海)有限公司生產(chǎn).

    1.2 實驗原理

    α—氨基酸在弱酸性溶液中與茚三酮共熱,引起氨基酸氧化脫氨、脫羧反應(yīng),最后茚三酮與反應(yīng)產(chǎn)物—氨和還原茚三酮發(fā)生作用,生成紫色物質(zhì),用分光光度法測定反應(yīng)后溶液的吸光度值,繪制絲氨酸濃度與吸光度值對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線.

    1.3 試驗步驟

    1.3.1 溶液的制備a.0.02 mol/L絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制:準(zhǔn)確稱取0.105 1 g L—絲氨酸(質(zhì)量分?jǐn)?shù)不低于99%)溶解定容至50 mL.b.0.04 mol/L茚三酮溶液的配制:稱取茚三酮0.356 3 g于50 mL離心管中,加25 mL水和0.014 3 g氯化亞錫(SnCl2),微微加熱使茚三酮溶解,放在暗處,靜置過夜,過濾后定容至50 mL.c.配制不同pH的緩沖溶液:醋酸—醋酸鈉緩沖液的pH分別為4.0、4.5、5.0、5.5,磷酸氫二鈉—磷酸二氫鈉緩沖液的pH分別為6.0、7.0.

    1.3.2 絲氨酸—茚三酮反應(yīng)及反應(yīng)產(chǎn)物的光譜掃描 反應(yīng)體系:準(zhǔn)確量取0.02 mol/L絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0.2 mL,pH值為6.0的緩沖溶液1.0 mL于10 mL容量瓶中,再加入1.0 mL的0.04 mol/L茚三酮溶液,定容至10 mL.混勻,取出混合液2 mL于10 mL具塞離心管中,加塞于沸水浴中反應(yīng)一定時間,取出置冰水中迅速冷卻至室溫.將絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)品與茚三酮反應(yīng)后的產(chǎn)物在UV-240紫外掃描儀上掃描,尋找400 nm與700 nm之間的最大吸收波長.

    1.3.3 顯色反應(yīng)條件的選擇 為了研究絲氨酸與茚三酮反應(yīng)的最佳條件,可改變1.3.2的反應(yīng)體系中的單一因素,并以相應(yīng)的空白值做對照,在最大吸收波長處測定吸光度,以確定反應(yīng)的最佳相對用量和時間.

    1.3.4 絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 確定最佳茚三酮用量、最佳反應(yīng)時間之后,控制絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液用量呈梯度變化,參照1.3.2的反應(yīng)體系,測定吸光度,將吸光度對濃度進(jìn)行直線回歸,得絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線及方程.

    1.3.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線準(zhǔn)確度的檢測 取一定體積的已知濃度的溶液,分別加入pH值為4.5,5.0和6.0的緩沖溶液,按上述方法分別測定其吸光度,從標(biāo)準(zhǔn)曲線上的數(shù)學(xué)表達(dá)式中計算出絲氨酸的質(zhì)量濃度,測三次取平均值.計算誤差值.

    2 結(jié)果與分析

    2.1 絲氨酸—茚三酮反應(yīng)產(chǎn)物的測定波長的測定

    將絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)品反應(yīng)后的產(chǎn)物在UV-240紫外掃描儀上掃描,絲氨酸和茚三酮反應(yīng)產(chǎn)物在570 nm處有最大吸收,故選擇570 nm為測定波長.

    2.2 單因素實驗

    2.2.1 絲氨酸與茚三酮相對用量的選擇 取1.0 mL濃度為0.02 mol/L的絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液于一組10 mL的容量瓶,瓶中加入1.0 mL pH4.5的緩沖溶液,分別往瓶中加入0.6,0.8,1.0,1.2,1.5,1.6,1.8,2.0,2.2 mL 0.04 mol/L茚三酮溶液,參照1.3.2顯色測定各顯色體系的吸光度,結(jié)果如圖所示.

    圖1 不同茚三酮用量對顯色體系吸光度的影響

    由圖1可知,取0.02 mol/L絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液用量為1.0 mL,茚三酮用量小于1.5 mL(摩爾比3∶1)時,隨著茚三酮用量的不斷增加,吸光度值不斷變大,當(dāng)茚三酮用量為1.5 mL(摩爾比3∶1)時,吸光度接近最大值,從保證實驗效果和節(jié)約顯色劑用量的角度考慮,茚三酮與絲氨酸的摩爾比為3∶1時比較恰當(dāng).

    2.2.2 反應(yīng)時間和pH值的選擇 取0.2 mL濃度為0.02 mol/L的絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液于一組容量瓶,向瓶中加入0.3 mL 0.04 mol/L 的茚三酮溶液,參照1.3.2顯色,研究不同反應(yīng)時間和不同pH值條件下的吸光度,結(jié)果如圖2所示.

    由圖2A可知,反應(yīng)時間30 min時有最大吸光度值.由圖2B可知,pH值對絲氨酸與茚三酮的顯色反應(yīng)有極大的影響,且不同pH值對其影響的規(guī)律并不明顯,這是因為在不同的pH值條件下,反應(yīng)的機理并不相同,生成的有色物質(zhì)也不一樣[21-22].為了準(zhǔn)確測定絲氨酸的含量,必須根據(jù)體系pH值的需要,測定不同pH值條件的絲氨酸含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線.

    A.不同反應(yīng)時間

    B.不同pH值條件

    2.3 幾種不同pH值條件下絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

    2.3.1 pH值為4.5的絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線 取一組10 mL的容量瓶,按表1依次加入0.02 mol/L絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液,各加入pH為4.5的緩沖溶液1.0 和1.5 mL茚三酮.在100 ℃條件下,反應(yīng)30 min.按1.3.2方法測定吸光度.結(jié)果如表1所示.

    表1 pH值為4.5時絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液數(shù)據(jù)

    以標(biāo)準(zhǔn)絲氨酸質(zhì)量濃度作橫坐標(biāo),以吸光度值作縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,求得其回歸方程為y=5.595x+0.056,相關(guān)系數(shù)R2= 0.991 2.

    圖3 絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(pH=4.5)

    2.3.2 pH值為5.0時的絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線 取一組10 mL的容量瓶,按表2依次加入0.02 mol/L絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液,各加入pH為5.0的緩沖溶液1.0 mL和0.525 mL茚三酮,在100 ℃條件下,反應(yīng)30 min.按1.3.2方法測定吸光度.結(jié)果如表2所示.

    表2 pH值為5.0時絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)

    以標(biāo)準(zhǔn)絲氨酸質(zhì)量濃度作橫坐標(biāo),以吸光度值作縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,求得其回歸方程為y=10.59x+0.023,相關(guān)系數(shù)R2=0.998 5.

    圖4 絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(pH=5.0)

    2.3.3 pH值為6.0時的絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線 取一組10 mL的容量瓶,按表2依次加入0.02 mol/L絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液,各加入pH為6.0的緩沖溶1.0和0.21 mL茚三酮.在100 ℃條件下,反應(yīng)30 min.按1.3.2方法測定吸光度.結(jié)果如表3所示.

    表3 pH值為6.0時絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)

    以標(biāo)準(zhǔn)絲氨酸質(zhì)量濃度作橫坐標(biāo),以吸光度值作縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,求得其回歸方程為y=37.824x+0.003 3,相關(guān)系數(shù)R2=0.991 5.

    圖5 絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(pH=6.0)

    2.4 方法準(zhǔn)確度的檢測

    配制濃度為0.01 mol/L的絲氨酸的標(biāo)準(zhǔn)溶液10 mL,分別用移液槍準(zhǔn)確量取體積為200 uL的溶液三份,放入標(biāo)號為1,2,3的三只10 mL的容量瓶中,據(jù)相對摩爾比為(3∶1)的比例,各加入0.02 mol/L的茚三酮溶液280 uL,然后依次加入500 uL,pH值分別為4.5,5.0和6.0的緩沖溶液,依1.3.2試驗步驟,測定三只容量瓶里溶液反應(yīng)后的吸光度,結(jié)果如表4所示.

    表4 絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線準(zhǔn)確度的檢測

    3 結(jié) 語

    用酶標(biāo)儀分光光度法確定了絲氨酸與茚三酮顯色反應(yīng)的最佳時間為30 min和相對摩爾比為1∶3,反應(yīng)的溫度為100 ℃.據(jù)絲氨酸磷脂制備體系反應(yīng)后測定絲氨酸含量的需要,筆者還測定了pH值分別為4.5,5.0和6.0時的絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線.pH值為4.5時,y=5.595x+0.056 (R2=0.991 2);pH值為5.0時,y=10.59x+0.023(R2=0.998 5);pH值為6.0時,y=37.388x+0.005 2(R2=0.991 5),用已知質(zhì)量濃度的絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液對標(biāo)準(zhǔn)曲線的準(zhǔn)確度進(jìn)行檢測,誤差范圍為-6.26%~+3.78%.應(yīng)用茚三酮—分光光度法測定由卵磷脂制備絲氨酸磷脂體系中的絲氨酸質(zhì)量濃度時,操作簡便,結(jié)果準(zhǔn)確,節(jié)約成本,重復(fù)性好.

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