中藥提取物中黃嘌呤氧化酶抑制劑的篩選

黎 莉, 戴立珍, 楊 靖, 方繼德

(武漢工程大學化工與制藥學院, 綠色化工過程教育部重點實驗室, 湖北 武漢 430074)

0 引 言

黃嘌呤氧化酶(Xanthine Oxidase, XOD)是體內核酸代謝中重要的酶, 能催化黃嘌呤和次黃嘌呤的氧化生成尿酸, 同時產生過氧化物自由基[1]．尿酸濃度過高將導致高尿酸血癥, 可引起痛風發(fā)作．自由基涉及到炎癥等一系列病理過程[2]．因此, 抑制XOD的活性, 既可以減少體內尿酸的形成, 有效地阻止或延緩痛風及其并發(fā)癥, 又可以減少自由基造成的組織傷害[3]．目前黃嘌呤氧化酶抑制劑(XOI)別嘌呤醇自上市后沿用至今, 是治療痛風的主要藥物．但常伴有發(fā)熱、過敏性皮疹、腹痛、腹瀉、白細胞及血小板減少, 肝功能損害等嚴重副反應[4]．因此, 研制開發(fā)新的黃嘌呤氧化酶抑制劑具有實際意義．

黃酮類化合物廣泛存在于中草藥中, 具有抗氧化、抗炎、抗病毒、抗癌、抗心腦血管疾病等多種藥理作用．根據(jù)有關文獻[5]中黃嘌呤氧化酶抑制劑的構效關系及應用前景, 筆者從多種中草藥制備提取物, 這些提取物主要含有黃酮類化合物[6-7], 并進行了體外黃嘌呤氧化酶抑制實驗．

1 實驗部分

1.1 實驗材料與儀器

枳椇子和高良姜購于武漢市雄楚大街三九藥店, 葛花購于湖北省中醫(yī)院, 這3種藥材均經(jīng)中南民族大學萬定榮教授鑒定．枳椇子為鼠李科植物枳椇(HoveniadulcisThunb)的干燥成熟種子．高良姜為姜科植物高良姜 (AlpiniaofficinarumHance)的干燥根莖．葛花為豆科植物野葛[Puerarialobata(Will.)Ohwi]的干燥花．

T6-新世紀紫外可見分光光度計 (北京普析通用儀器公司), 帶有動力學/時間軟件． 黃嘌呤氧化酶(北京世紀山水科技公司), 黃嘌呤(Sigma公司), 槲皮素(中國藥品生物制品檢定所), 二甲基亞砜(Amresco公司), 其余試劑均為分析純．

1.2 植物提取物的制備

分別將各種植物材料粉碎成粗粉, 稱取材料10.0 g用索氏提取器進行提取, 溶劑為不同濃度的乙醇和乙酸乙酯．提取液用旋轉蒸發(fā)器回收溶劑, 干燥剩余物, 分別得到各種提取物．

1.3 研究方法

1.3.1 溶液配制 緩沖液：取K2HPO4、KH2PO4、EDTA-2Na溶于500 mL水, 配成 0.2 mol/L 緩沖溶液 (pH7.5)．酶溶液：取黃嘌呤氧化酶, 用緩沖液配成濃度為1.144 units/mL的溶液．測試過程中利用冰袋保持低溫, 需每天配制．底物溶液：精密稱取黃嘌呤溶于水, 制得0.10 mmol/L和0.05 mmol/L底物溶液, 室溫保存．樣品和對照品溶液：精密稱取各樣品及陽性對照品槲皮素, 分別用二甲基亞砜(DMSO)溶解, 得到不同濃度的溶液．

1.3.2 酶活力測定 在適宜條件下, 黃嘌呤被黃嘌呤氧化酶催化生成尿酸, 產物尿酸290 nm處有特征吸收峰, 因此以每分鐘290 nm處吸光度的增加來計算酶活力(dA/min)(dA為吸光度的增加值)．在任意一個適當長的時間段內, 吸光度隨時間呈線性增加, 斜率為反應速率(dA/min), 斜率越大, 說明酶的活力越強, 具體操作參照文獻[5]．在石英比色皿中, 加入緩沖溶液、底物溶液、酶溶液, 測定290 nm處吸光度增加值, 每隔0.5 s記錄一次, 共測 1 min, 得到一條關于吸光度—時間的直線, 計算直線斜率Rate(dA/min)．

1.3.3 樣品測定 按同樣的方法, 在酶促反應體系中加入適量樣品溶液, 每隔0.5 s記錄290 nm處吸光度變化值, 共計1 min．每個樣品平行操作3次, 取其平均值計算該樣品的抑制率．

1.3.4 空白對照 同上述操作, 加與樣品同樣體積的DMSO, 不加樣品和XOD．

1.3.5 XOD對照品測定 方法與樣品測定相同, 不加樣品．

1.3.6 陽性對照品 為核對實驗方法與結果的可信性, 取已配制好的不同濃度的槲皮素溶液, 重復上述實驗, 計算IC50值．

1.3.7 抑制動力學常數(shù)Ki值的測定及計算 使用2個不同濃度的黃嘌呤溶液, 獲得不同濃度樣品溶液對XOD的反應速率, 用Dixon繪圖法計算Ki值[8]．

2 結果與討論

2.1 樣品對XOD的抑制率

計算公式為[(Rp- Rs)/Rp ] ×100%．式中 Rs、Rp分別表示樣品、XOD對照品(已減去空白對照)的反應速率．按照上述方法進行分析, 底物濃度為0.10 mmol/L, 樣品濃度均為100 μg/mL, 槲皮素為10 μg/mL, 得到對黃嘌呤氧化酶抑制作用較強的植物提取物, 分別為枳椇子乙醇提取物、高良姜乙醇提取物和葛花乙酸乙酯提取物．其抑制率如表1所示．

表1 各提取物對XOD的抑制效果

2.2 半數(shù)抑制濃度IC50

以抑制率為因變量, 以樣品濃度為自變量, 采用SPSS 15.0統(tǒng)計軟件包計算回歸方程．根據(jù)回歸方程計算抑制率為50%的樣品濃度IC50．實驗結果如表1所示．

2.3 Ki值計算和抑制劑類型

用Dixon繪圖法計算Ki值, 判斷抑制劑類型．在不同濃度的底物下, 以反應速率的倒數(shù)為因變量, 樣品濃度為自變量, 得到一條直線．采用 SPSS 15.0統(tǒng)計軟件包計算回歸方程．求出兩直線的交點, 可得到抑制動力學參數(shù)Ki[9]．再由直線的斜率對相應的底物濃度的倒數(shù)二次作圖, 即可判斷抑制劑類型[10]．本實驗中的植物提取物均為競爭性抑制劑, 其動力學參數(shù)如表1和圖1～4所示．

圖1 黃嘌呤/黃嘌呤氧化酶體系中枳椇子的Dixon圖

圖2 黃嘌呤/黃嘌呤氧化酶體系中高良姜的Dixon圖

圖3 黃嘌呤/黃嘌呤氧化酶體系中葛花的Dixon 圖

圖4 黃嘌呤/黃嘌呤氧化酶體系中槲皮素的Dixon圖

3 討論

a．IC50值反映樣品對黃嘌呤氧化酶活性抑制的強弱, 該數(shù)值低則抑制作用強．枳椇子乙醇提取物抑制作用最強．Ki值是表征抑制劑對酶促反應抑制效率的重要參數(shù), 該值越小, 則表明抑制劑對該酶促反應抑制效果好．與化學單體槲皮素相比, 本實驗篩選的3種提取物的IC50值和Ki值較大, 但由于提取物是混合物, 經(jīng)濟且制備容易, 還具有多重作用, 故仍然具有實際意義和應用價值．

b．枳椇子、高良姜和葛花屬常用中藥, 長期用于治療各種疾病, 毒性?。匆娖湟种泣S嘌呤氧化酶活性而治療痛風的報導．本實驗將對其做后續(xù)研究, 有可能發(fā)現(xiàn)其新用途, 為充分利用這些植物資源提供依據(jù)．

參考文獻：

[1]吳曉生, 李龍官．比色法測定黃嘌呤氧化酶[J]．生物化學與生物物理進展, 1986(5):65-67．

[2]Hatliwelt B, Gutteridge J M, Cross C E．Free radicals, aIl-tioxidants, and human diseases：where are we now[J]．J Lab Clin Med,1992, 119(6)：598-620．

[3]黎莉, 陳科力, 方繼德．中草藥來源的黃嘌呤氧化酶抑制劑的研究進展[J]．中藥材, 2006, 29(12)：1386-1389．

[4]王春輝．基于結構的黃嘌呤氧化酶抑制劑的設計、合成和篩選[D]．沈陽：沈陽藥科大學制藥工程學院, 2006．

[5]Cos P, Ying L, Calomme M, et a1．Structure activity relationship and classification of flavonoids as inhibitors of xanthine oxidase and superoxide scanvengers[J]．J Nat Prod, 1998, 61：6171．

[6]文為, 張洪, 曾嶸枳．枳椇子中總黃酮的提取工藝優(yōu)化[J]．中國藥師, 2007, 10(10): 965-967．

[7]羅小平, 梁兆強, 楊曉紅．高良姜中黃酮類化合物的提取及精制研究[J]．安徽農業(yè)科學, 2008, 36(33)：14593-14595, 14599．

[8]陳科力, 葉叢進, Plumb G W, 等．異葉蛇葡萄和蛇葡萄提取物抑制黃嘌呤氧化酶和脂質氧化酶的活性研究[J]．中藥材, 2004, 27(9):650-653．

[9]張海德, 黃玉林, 何繼芹．丹參二萜醌對黃嘌呤氧化酶活性的抑制作用[J]．中國藥理學與毒理學雜志，2007, 21(3):174-178．

[10]郭勇, 鄭穗平．酶學[M]．廣州：華南理工大學出版社, 2000：109-110．