高效毛細(xì)管電泳法測(cè)定新疆紫草中左旋紫草素的含量

白 研，毋福海，羅碧蓮，曾春麗

（廣東藥學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，廣州市 510310）

紫草為紫草科植物新疆紫草Arnebia euchroma.(Royle)Johnst.或內(nèi)蒙紫草 Arnebia guttata Bunge的干燥根[1，2]。前者習(xí)稱“軟紫草”，后者習(xí)稱“硬紫草”。其中新疆紫草更為常用，其味甘、咸，性寒，歸心、肝經(jīng)，具有涼血、活血、解毒透疹等功效。臨床常用于治療血熱毒盛、斑疹紫黑、麻疹不透、皰癢、陰道炎、嬰兒皮疹、水火燙傷等，具有很強(qiáng)的抗細(xì)菌、抗真菌、抗腫瘤、保肝和調(diào)節(jié)免疫等作用[3]。紫草根部含有萘醌類色素，包括紫草素、乙酰紫草素、丙烯酰紫草素、異丁酰紫草素、β，β′-二甲基丙烯酰紫草素等多種色素成分，多以左旋紫草素的含量作為紫草提取物的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。文獻(xiàn)報(bào)道左旋紫草素的測(cè)定方法有薄層掃描法[4]、高效液相色譜法[5～7]等。以毛細(xì)管電泳法進(jìn)行測(cè)定，相關(guān)報(bào)道[8]為采用高頻電導(dǎo)檢測(cè)器，而電化學(xué)檢測(cè)普遍存在的弱點(diǎn)為重現(xiàn)性較差，以此作為藥材的質(zhì)量控制方法較為不利。本試驗(yàn)采用紫外檢測(cè)器，通過(guò)改善一系列電泳條件，建立了對(duì)新疆紫草中左旋紫草素分離、測(cè)定的高效毛細(xì)管電泳（HPCE）法。

1 材料

1.1 儀器

CL1030型HPCE儀（北京彩陸科學(xué)儀器有限公司）；K-2501型紫外-可見(jiàn)檢測(cè)器（德國(guó)諾爾公司）；HW-2000型色譜工作站（2.17版，南京千譜軟件有限公司）；pHS-3C型精密酸度計(jì)（上海虹益儀器儀表有限公司）；DL-360型超聲波清洗器（寧波市石浦海天電子儀器廠）。

1.2 試藥

左旋紫草素對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：0769-9903）；新疆紫草藥材購(gòu)自北京同仁堂，經(jīng)廣東藥學(xué)院中藥學(xué)院孟江副教授鑒定為真品；所用試劑為優(yōu)級(jí)純或分析純，水為二次蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對(duì)照品貯備液 精密稱取左旋紫草素對(duì)照品9.0 mg，加適量甲醇溶解后定容至25 mL，即得（360.0 μg·mL-1），4 ℃貯藏。臨用時(shí)稀釋成各濃度的對(duì)照品溶液。

2.1.2 供試品溶液 精密稱取適量干燥的紫草粉末，置于50 mL錐形瓶中，加甲醇25 mL，準(zhǔn)確稱量，超聲30 min，放冷，補(bǔ)充甲醇至初始質(zhì)量，搖勻，過(guò)濾，棄去初濾液，續(xù)濾液用0.45 μm濾膜過(guò)濾，即得。

2.2 電泳操作條件

采用未涂層彈性融硅石英毛細(xì)管（53 cm×50 μm ID，有效長(zhǎng)度46 cm），運(yùn)行電壓14 kV，重力虹吸方式進(jìn)樣，高度25 cm，進(jìn)樣時(shí)間15 s，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)516 nm。試驗(yàn)在恒溫（25℃）、恒濕（60%）條件下進(jìn)行。

毛細(xì)管在使用前，依次用二次蒸餾水沖洗10 min、0.1 mol·L-1NaOH溶液沖洗5 min、二次蒸餾水沖洗5 min、運(yùn)行緩沖溶液沖洗10 min，所需電泳緩沖液均經(jīng)過(guò)超聲脫氣20 min。在2次運(yùn)行之間，用運(yùn)行緩沖溶液沖洗2 min。

2.3 電泳條件的優(yōu)化

2.3.1 緩沖溶液的選擇 試驗(yàn)考察了Tris-鹽酸（pH 7.0～9.0）、Tris-H3BO3（pH 7.5～9.0）、Na2HPO4-NaH2PO4（pH 6.6～7.8）、硼砂-HAc（pH 7.0～8.5）、H3BO3-三乙胺（pH 7.5～9.2）、H3BO3-二乙胺（pH 7.5～9.2）緩沖體系。此外，還檢測(cè)了Tris-檸檬酸（pH 7.0～9.0）、H3BO3-硼 砂（pH 7.4～9.0）、H3BO3-NaCl-硼砂（pH 7.0～9.2）、硼砂-KH2PO4（pH 7.0～9.2）、硼砂-Na2CO3（pH 9.2～1.0）、硼砂（pH 9.2）對(duì)樣品中左旋紫草素分離效果的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在H3BO3-二乙胺和H3BO3-三乙胺緩沖體系中，左旋紫草素出峰相對(duì)較好。又比較H3BO3-二乙胺和H3BO3-三乙胺2種緩沖體系，發(fā)現(xiàn)在H3BO3-二乙胺緩沖體系中，背景噪聲和拖尾因子較大；在H3BO3-三乙胺緩沖體系中，左旋紫草素與其衍生物的分離效果較好，基線平穩(wěn)，故最終選用了H3BO3-三乙胺緩沖體系。

由于考慮到運(yùn)行緩沖液的濃度及配比影響被測(cè)物的分離度與遷移時(shí)間，故試驗(yàn)中利用正交試驗(yàn)法考察了H3BO3與三乙胺不同濃度及配比對(duì)左旋紫草素及其衍生物分離情況的影響，得出2.0 mmol·L-1H3BO3+6.0 mmol·L-1三乙胺的緩沖體系分離效果最佳。

2.3.2 有機(jī)改性劑的選擇 在電泳過(guò)程中，緩沖溶液中加入有機(jī)溶劑可以影響介質(zhì)黏度、介電常數(shù)及雙電層結(jié)構(gòu)等，進(jìn)而影響電滲流及遷移行為，達(dá)到調(diào)節(jié)選擇性、改善分離度的目的[9]。試驗(yàn)中考察了乙醇、甲醇、丙二醇、丙酮、β-環(huán)糊精（β-CD）、十二烷基硫酸鈉（SDS）等幾種添加劑不同加入量對(duì)分離和檢測(cè)的影響，發(fā)現(xiàn)緩沖溶液中加入β-CD時(shí)，可使左旋紫草素峰形變得尖銳，峰高、峰面積明顯增大。比較加入不同濃度的β-CD對(duì)左旋紫草素分離的影響，發(fā)現(xiàn)加入5.0 mmol·L-1β-CD分離效果最好，其它幾種添加劑對(duì)分離檢測(cè)無(wú)改善。因此，后續(xù)試驗(yàn)選擇添加 5.0 mmol·L-1β-CD 的 2.0 mmol·L-1H3BO3+6.0 mmol·L-1三乙胺緩沖體系（pH 8.9）作為電泳介質(zhì)。

2.3.3 分離電壓和進(jìn)樣時(shí)間的選擇 試驗(yàn)考察了8.0～23.0 kV電壓范圍內(nèi)樣品的分離情況，綜合考慮分離度、分離時(shí)間、峰展寬、靈敏度、噪聲等因素，優(yōu)化選擇14 kV為分離電壓。

進(jìn)樣時(shí)間決定了進(jìn)樣量的大小，時(shí)間太短會(huì)影響檢測(cè)的靈敏度，時(shí)間太長(zhǎng)又會(huì)影響分離效率和分離度。本試驗(yàn)以重力進(jìn)樣，進(jìn)樣高度為25 cm，在14 kV分離電壓下，考察了進(jìn)樣時(shí)間對(duì)分離效果的影響，選擇最佳進(jìn)樣時(shí)間為15 s。

在上述優(yōu)化試驗(yàn)條件下的電泳圖見(jiàn)圖1。

圖1 毛細(xì)管電泳圖A.對(duì)照品；B.紫草；1.左旋紫草素；2.甲醇；3.未知物Fig 1 Capillary electrophoretogramA.control substance；B.A.euchroma；1.shikonin；2.methanol；3.unknown substances

2.4 精密度試驗(yàn)

在優(yōu)化電泳條件下，分別取10.8、25.2 μg·mL-12種濃度的左旋紫草素對(duì)照品溶液，各重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積。結(jié)果，RSD分別為1.60%、1.63%，表明儀器精密度良好。

2.5 線性關(guān)系考察

取適量對(duì)照品貯備液，分別加甲醇稀釋成含左旋紫草素7.2、10.8、14.4、18.0、21.6、25.2、28.8、36.0 μg·mL-1的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，在優(yōu)化電泳條件下重力進(jìn)樣測(cè)定。以對(duì)照品峰面積積分值（Y）為縱坐標(biāo)，濃度（C）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為Y＝578.24C－431.18（r＝0.9990）。結(jié)果表明，左旋紫草素檢測(cè)濃度在7.2～36.0 μg·mL-1范圍內(nèi)與其峰面積積分值呈良好線性關(guān)系。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密稱取紫草藥材粉末0.9 g，加甲醇25 mL，按“2.1.2”項(xiàng)下方法處理后稀釋2倍，分別在0、2、4、6、8、10、12 h按優(yōu)化電泳條件分析測(cè)定。結(jié)果，RSD＝0.85%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)測(cè)定結(jié)果穩(wěn)定。

2.7 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取0.050 g紫草藥材粉末6份，將左旋紫草素對(duì)照品按3種水平分別加入紫草樣品中，各平行2份，按“2.1.2”項(xiàng)下方法處理后在優(yōu)化電泳條件下進(jìn)樣分析，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab 1 Results of recovery test（n＝6）

2.8 樣品含量測(cè)定

精密稱取適量紫草粉末，平行6份，以甲醇為溶劑，液料比為50∶1，室溫下超聲30 min，按照“2.1.2”項(xiàng)下方法分別制備供試品溶液，在優(yōu)化電泳條件下分別測(cè)定。結(jié)果，樣品中左旋紫草素的平均含量為3.85 mg·g-1，RSD＝2.32%。

3 討論

本試驗(yàn)以紫外檢測(cè)器建立了測(cè)定左旋紫草素的HPCE法。通過(guò)對(duì)緩沖溶液組成、pH值、濃度、添加有機(jī)改性劑以及分離電壓和進(jìn)樣時(shí)間對(duì)左旋紫草素與其衍生物分離情況的影響研究，確立了實(shí)現(xiàn)左旋紫草素與其衍生物有效分離的HPCE條件。在此條件下，左旋紫草素保留時(shí)間約為5 min，與相關(guān)文獻(xiàn)[8]比較分離時(shí)間縮短。

試驗(yàn)中供試品溶液是以甲醇為溶劑、超聲提取紫草樣品而得，經(jīng)正交試驗(yàn)優(yōu)化左旋紫草素提取工藝條件，在此條件下左旋紫草素含量為3.85 mg·g-1，與相關(guān)文獻(xiàn)[10]比較測(cè)定含量相符，但本試驗(yàn)以甲醇為溶劑提取左旋紫草素使收率有一定提高。

[1]唐漢均，王春麗.麻油提取紫草工藝條件優(yōu)選[J].上海中醫(yī)藥雜志，2005，39（11）：58.

[2]國(guó)家藥典委員會(huì)編.中華人民共和國(guó)藥典（一部）[S].2005年版.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：238.

[3]李曉瑾，譚秀芳，馬 媛，等.藥用植物紫草的研究進(jìn)展[J].新疆師范大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，24（4）：69.

[4]劉 芳，王小平，伍偉禎.薄層掃描法測(cè)定燒傷膏中左旋紫草素的含量[J].基層中藥雜志，2001，15（2）：21.

[5]Yani Hu，Zhihong Jiang，Kelvin Sze-Yin Leung，et al.Simultaneous determination of naphthoquinone derivatives in Boraginaceous herbs by high-performance liquid chr-omatography[J].Analytica Chimica Acta，2006，577：26.

[6]郭紅軍，簡(jiǎn)麗娜，孔煥宇，等.高效液相色譜法測(cè)定玉紅膏中紫草素的含量[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2006，17（4）：489.

[7]許紅蘭，姜 哲.HPLC法測(cè)定復(fù)方紫草油中左旋紫草素的含量[J].現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生，2008，24（21）：3211.

[8]李全文，陳纘光，周 勰，等.毛細(xì)管電泳法測(cè)定紫草中的紫草素[J].分析化學(xué)，2006，34（7）：991.

[9]明永飛，孫玉希，尤進(jìn)茂.氨基酸衍生物在毛細(xì)管區(qū)帶電泳下的分離研究[J].化學(xué)研究，2003，14（3）：9.

[10]白 研，宋粉云，毋福海，等.正交試驗(yàn)優(yōu)選紫草提取工藝[J].中藥新藥與臨床藥理，2006，17（4）：288.