不同樣品制備方法對(duì)RP-HPLC法測(cè)定附子生物堿含量的影響Δ

侯大斌，趙祥升

（西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，綿陽(yáng)市 621010）

附子為毛茛科烏頭Aconitum carmichaeli Debx.的子根，有效成分為烏頭類生物堿：烏頭堿（aconitine）、中烏頭堿（mesaconitine）與次烏頭堿（hypaconitine）等，是我國(guó)常用的中藥和四川道地藥材，具有抗炎、鎮(zhèn)痛、強(qiáng)心、抗心律失常、降血糖、毒性等藥理作用，有回陽(yáng)救逆、補(bǔ)火助陽(yáng)、散寒除濕的功效。近年來現(xiàn)代藥理學(xué)研究證明，附子提取液還具有抗癌、抗衰老和增強(qiáng)免疫機(jī)能等作用[1～3]。附子中單一生物堿的檢測(cè)最常用的是高效液相色譜（HPLC）法，并具有高溫、高速、高靈敏度、高分辨度等優(yōu)點(diǎn)，烏頭堿類分子極性較強(qiáng)，比較適合用HPLC分析[4]。目前，附子中3種二萜生物堿HPLC法測(cè)定的樣品制備方法比較多，本文主要比較不同附子樣品制備方法的提取效果，選擇合適的樣品制備方法，優(yōu)化3種生物堿的分離效果和出峰時(shí)間，為附子中3種生物堿含量的測(cè)定和附子質(zhì)量控制提供科學(xué)的依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

1200LC-MS型液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（包括紫外檢測(cè)器，美國(guó)Varian公司）；紫外-可見近紅外光譜儀（日本島津公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士Buchi公司）；BP211D型電子分析天平（德國(guó)Sartorius公司）；超純水制造系統(tǒng)（上海優(yōu)普實(shí)業(yè)有限公司）；超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；中草藥粉碎機(jī)（天津泰斯特儀器有限公司）；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海福瑪實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）。

1.2 試藥

甲醇、乙腈、乙二胺為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純；烏頭堿（批號(hào)：110797-200404）、新烏頭堿（批號(hào)：110799-200404）、次烏頭堿（批號(hào)：110798-200404）對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所）；試驗(yàn)材料為2007年12月在四川江油附子GAP基地收獲的新鮮附子，經(jīng)西南科技大學(xué)侯大斌教授鑒定為A.carmichaeli Debx.的子根。附子先用自來水清洗干凈，再用蒸餾水漂洗2次，切成0.3 cm厚的片狀，裝入牛皮紙袋放入烘箱，在105℃烘30 min，在60～70℃下烘干至恒重，粉碎過60目篩，4℃冰箱保存，備用。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品制備方法

方法1：按2005年版《中國(guó)藥典》（一部）方法[1]操作。方法2：將附子藥材粉碎，過60目篩，取藥材粉末0.5 g，加濃氨試液2 mL潤(rùn)濕，加乙醚20 mL，超聲處理50 min，過濾，用乙醚洗滌3次，每次10 mL，收集、合并所有濾液，于水浴上揮干溶劑，加入甲醇溶解殘?jiān)?，過濾，定容至10 mL的容量瓶中，作為供試品溶液。方法3：精密稱取樣品0.5 g，滴加濃氨水2 mL浸潤(rùn)，再加入20 mL二氯甲烷，超聲處理50 min，過濾，濃縮，用二氯甲烷定容至10 mL的容量瓶中。方法4：精密稱取樣品0.5 g，加95%乙醇50 mL，加熱回流2 h，回收溶劑，殘?jiān)?0 mL、pH值2～3的鹽酸溶液溶解，用10 mL氯仿萃取3次，除去氯仿層，用NaOH溶液調(diào)節(jié)水溶液的pH值為9～10，再用氯仿萃取3次，蒸干氯仿，用甲醇定容至10 mL的容量瓶中，作為供試品溶液。方法5：精密稱取樣品0.5 g，滴加濃氨水2 mL浸潤(rùn)，加入95%的乙醇20 mL，超聲處理50 min，以下步驟與方法4相同。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

分別精密稱取新烏頭堿、烏頭堿、次烏頭堿對(duì)照品適量，分別置于10 mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容，搖勻，得各單一成分對(duì)照品貯備液；其它不同濃度的對(duì)照品溶液由貯備液稀釋得到。

2.3 色譜條件

色譜柱：Zorbax extend-C18（150 mm×4.6 mm，5.0 μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.1%乙二胺（梯度洗脫：0→15→30→35→60種min，乙腈體積分?jǐn)?shù)為35%→50%→75%→35%→35%）；流速：1 mL·min-1；柱溫：30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：240 nm。

2.4 試驗(yàn)條件的選擇

2.4.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 已有文獻(xiàn)報(bào)道，3種生物堿混合溶液的最大吸收波長(zhǎng)有230、235、240 nm 3種[5～8]。將3種生物堿的3種溶液適量混合后檢測(cè)，最大的吸收波長(zhǎng)為240 nm。同時(shí)，在此波長(zhǎng)下峰面積最大，達(dá)到基線分離，基線也更穩(wěn)定，故確定檢測(cè)波長(zhǎng)為240 nm。

2.4.2 流動(dòng)相的選擇 新烏頭堿、烏頭堿、次烏頭堿的極性由強(qiáng)到弱。在RP-HPLC中，由于醇-水系統(tǒng)熱力學(xué)和可壓縮性因素，在梯度洗脫時(shí)，易導(dǎo)致基線漂移[9]，同時(shí)甲醇的洗脫能力不強(qiáng)。因此，在試驗(yàn)中選擇了洗脫能力較強(qiáng)的乙腈作為流動(dòng)相。流動(dòng)相中加入乙二胺可以防止分離過程出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象，達(dá)到改善色譜峰形和提高分離度的目的。比較不同配比乙腈-0.1%乙二胺溶液對(duì)新烏頭堿、烏頭堿、次烏頭堿保留時(shí)間、分離度及峰形的影響，當(dāng)乙腈的比例過大時(shí)，出峰雖然早，但是3個(gè)峰的分離效果不好。最后確定流動(dòng)相為上述色譜條件時(shí)，3種生物堿的分離效果最優(yōu)。色譜見圖1。

圖1 高效液相色譜圖A.對(duì)照品；B.供試品；a.新烏頭堿；b.烏頭堿；c.次烏頭堿Fig 1 HPLC chromatogramsA.reference substance；B.test sample；a.mesaconitine；b.aconitine；c.hypaconitine

2.5 線性關(guān)系的考察

準(zhǔn)確吸取新烏頭堿、烏頭堿、次烏頭堿貯備液適量，分別置于10 mL容量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，振蕩均勻，作為對(duì)照品稀釋液。在同一色譜條件下分別進(jìn)量20 μL，確定標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的保留時(shí)間。然后各取一定體積的貯備液配成不同濃度的混合對(duì)照品溶液，分別平行測(cè)定3次（均進(jìn)樣20 μL），以平均峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度（X，μg·mL-1）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸。各物質(zhì)的回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍見表1。

表1 3種生物堿的回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍Tab 1 Regression equations，correlation coefficients and linear ranges of 3 kinds of alkaloids

2.6 不同樣品制備方法的生物堿含量測(cè)定

在上述色譜條件下，取不同方法制備處理的供試品溶液適量，用0.45 μm微孔濾膜濾過，取20 μL為進(jìn)樣量，分別平行進(jìn)樣3次，以平均峰面積按回歸方程計(jì)算濃度。不同處理方法測(cè)得3種生物堿的含量見表2。結(jié)果，“方法2”的提取率最高，3種生物堿的含量在各處理方法中均是最高。

表2 不同處理方法的生物堿含量（n＝3）Tab 2 Content of alkaloids prepared by different sample preparations（n＝3）

2.7 精密度試驗(yàn)

精密吸取“方法2”的供試品溶液20 μL，重復(fù)進(jìn)樣5次，進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果，新烏頭堿、烏頭堿、次烏頭堿峰面積RSD分別為1.04%、1.47%、1.01%，表明方法的精密度良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

對(duì)“方法2”供試品溶液在8 h之內(nèi)每隔1 h進(jìn)行1次考察。結(jié)果，新烏頭堿、烏頭堿、次烏頭堿峰面積的RSD分別為1.60%、1.72%、1.23%（n＝9），表明供試品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.9 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱量干燥附子粉末0.5 g共5份，按照“方法2”制備后進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果，新烏頭堿、烏頭堿、次烏頭堿峰面積的RSD分別為1.35%、2.07%、1.29%，表明方法的重復(fù)性較好。

2.10 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱量干燥附子粉末0.5 g共5份，每份分別加入各對(duì)照品貯備液，使新烏頭堿、烏頭堿、次烏頭堿的加入量分別為450、200、400 μg。按“2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液后進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見表3。

表3 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝5）Tab 3 Results of recovery test（n＝5）

2.11 含量測(cè)定

取干燥的附子粉末0.5 g，按照“2.1”項(xiàng)下“方法2”制備樣品，在上述色譜條件下測(cè)定附子中3種生物堿的含量。結(jié)果，附子中新烏頭堿、烏頭堿和次烏頭堿的含量分別為1.34、0.383、1.33 mg·g-1（n＝3）。

3 討論

HPLC法測(cè)定附子中生物堿的含量的樣品制備方法主要是超聲和加熱回流2種。加熱回流往往時(shí)間長(zhǎng)、步驟較多，過程中流失的生物堿較多，“2.1”項(xiàng)下“方法4”和“方法5”就是因?yàn)椴襟E繁多，因此測(cè)得含量較低，在HPLC法測(cè)定生物堿含量的樣品制備中應(yīng)該盡量減少操作的步驟。藥典法的測(cè)試樣品用量大、時(shí)間長(zhǎng)，主要是以測(cè)烏頭堿的含量為主，不是對(duì)3種組分同時(shí)測(cè)定。3種生物堿都是堿性成分，藥材粉末的堿化程度會(huì)影響到提取率，本試驗(yàn)用氨水濕潤(rùn)，再加入不同的提取試劑，超聲使藥材分散，易于溶劑滲透，使提取效率提高。超聲時(shí)間影響到脂溶性生物堿的提取效率，本試驗(yàn)比較了在同一頻率及溫度條件下的超聲時(shí)間，發(fā)現(xiàn)在50 min時(shí)的提取率最高，時(shí)間加長(zhǎng)后提取率差異不大，因此本試驗(yàn)選擇50 min為超聲時(shí)間。

對(duì)照品的溶解在以前人們用的主要是非惰性有機(jī)溶劑甲醇、乙醇，但是在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)對(duì)照品的混合液放置12 h后，在主峰的附近會(huì)出現(xiàn)雜峰，說明生物堿在這些溶劑中可能發(fā)生醇解反應(yīng)。因此，本試驗(yàn)改為乙腈溶解對(duì)照品。

本試驗(yàn)的樣品處理用乙醚超聲法提取，新烏頭堿、烏頭堿和次烏頭堿的分離效果較好、出峰時(shí)間短、回收率較高、操作簡(jiǎn)便，是附子3種生物堿含量測(cè)定中樣品制備的首選方法。該方法可為附子中3種生物堿的含量測(cè)定和成分研究提供科學(xué)的依據(jù)。

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