阿奇霉素膠囊人體生物等效性研究

歐明洪，何海霞，賈旭明（1.四川達(dá)州市中心醫(yī)院藥學(xué)部，達(dá)州市 65000；2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院臨床藥理研究室，重慶市 400016；.四川達(dá)州市食品藥品檢驗(yàn)所，達(dá)州市 65000）

阿奇霉素（Azihromycin）[1]為半合成的十五元大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素，其游離堿供口服，乳糖酸鹽供注射。本品的抗菌譜與紅霉素相近，作用較強(qiáng)，臨床上用于敏感微生物所致的呼吸道、皮膚和軟組織感染。為評(píng)價(jià)四川科創(chuàng)制藥有限公司研制的2種規(guī)格的阿奇霉素膠囊在健康男性受試者的藥動(dòng)學(xué)特征及與杭州愛(ài)大制藥有限公司生產(chǎn)的阿奇霉素膠囊是否等效，本文采用微生物法測(cè)定其血藥濃度，并對(duì)其藥動(dòng)學(xué)和生物等效性進(jìn)行了研究，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料

指示菌：藤黃微球菌（編號(hào)：28001）；受試制劑1：阿奇霉素膠囊（四川科創(chuàng)制藥有限公司,規(guī)格：每粒0.25 g，批號(hào)：20030605，含量：99.83%）；受試制劑2：阿奇霉素膠囊（四川科創(chuàng)制藥有限公司,規(guī)格：每粒0.125g，批號(hào)：20030615，含量：92.8%）；參比制劑：阿奇霉素膠囊（杭州愛(ài)大制藥有限公司，規(guī)格：每粒0.25g，批號(hào)：040611；批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H10970148）；阿奇霉素標(biāo)準(zhǔn)品（中國(guó)藥品生物制品檢定所出品，購(gòu)于重慶市藥品檢驗(yàn)所，批號(hào)：130352-200203，規(guī)格：946 IU·mg－1）。

2 方法

2.1 研究對(duì)象

21名男性健康志愿者，漢族，平均年齡（23.6±2.27）歲（21～30歲）；平均體質(zhì)量（60.2±5.80）kg（52～75 kg）；平均身高（169.7±5.87）cm（160～182 cm）。試驗(yàn)前所有受試者肝功、腎功、血壓、心電圖檢查均正常。本試驗(yàn)經(jīng)四川達(dá)州市中心醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批通過(guò)，受試者于充分了解試驗(yàn)內(nèi)容后志愿簽署知情同意書(shū)。

2.2 給藥方案

將21名受試者采用拉丁方設(shè)計(jì)，隨機(jī)分為A、B、C組，每組7人。試驗(yàn)前禁食12 h后，于次日晨8時(shí)，A、B、C組受試者分別交叉空腹吞服500 mg[2]受試制劑1、受試制劑2或參比制劑（200 mL溫開(kāi)水服藥）。服藥當(dāng)日統(tǒng)一進(jìn)標(biāo)準(zhǔn)餐。受試期間禁止大量活動(dòng)，禁止吸煙、飲酒及含酒精、咖啡因類(lèi)飲料，試驗(yàn)期間禁用一切非試驗(yàn)藥物。

2.3 血樣采集

A、B、C組受試者分別空腹吞服500 mg受試制劑1、受試制劑2或參比制劑（Ⅰ周期）后0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、6.0、8.0、12、24、48、72、96、144 h時(shí)抽取前臂靜脈血 3.0 mL，分離血清，低溫保存（－20℃），待測(cè)。間隔2周后B、C、A組受試者分別空腹吞服500 mg受試制劑1、受試制劑2或參比制劑（Ⅱ周期），按上述方法采取靜脈血。再間隔2周后，C、A、B組受試者分別空腹吞服500 mg受試制劑1、受試制劑2或參比制劑（Ⅲ周期），按上述方法采取靜脈血（注：文獻(xiàn)報(bào)道[2，3]，本品tmax為2 h左右，t1/2為48 h左右，根據(jù)《中國(guó)藥典》2005年版“藥物制劑生物利用度和生物等效性試驗(yàn)指導(dǎo)原則”的要求，我們?cè)谶_(dá)峰時(shí)間前取樣3～4個(gè)點(diǎn)，在峰時(shí)間后取樣8～10個(gè)點(diǎn)，取樣持續(xù)到5個(gè)半衰期以上或終末濃度為峰濃度的10－1～20－1）。

2.4 血清樣品檢測(cè)（微生物杯碟法）

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)液的配制：準(zhǔn)確稱(chēng)取阿奇霉素標(biāo)準(zhǔn)品，用無(wú)水乙醇溶解后加緩沖液（pH7.8）稀釋成1 mg·mL－1標(biāo)準(zhǔn)貯備液，置－40℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

2.4.2 指示菌 ：選用藤黃微球菌（編號(hào)28001）[2，3]。

2.4.3 培養(yǎng)基Ⅱ號(hào)[4]：蛋白胨6 g，牛肉浸膏1.5 g，酵母浸膏6 g，葡萄糖1 g，瓊脂20 g，蒸餾水1000 mL，調(diào)pH 7.8～8.0，在115℃滅菌30 min后備用。

2.4.4 測(cè)定方法：參照文獻(xiàn)[5]，將培養(yǎng)基Ⅱ號(hào)熔化后冷至約50℃，加入適量藤黃微球菌菌液，混勻，于超凈工作臺(tái)上倒入經(jīng)高壓滅菌的平皿中（12 mL/皿），冷凝后放入不銹鋼小杯，每個(gè)血樣分別加入2個(gè)小杯，同時(shí)另放2個(gè)小杯，內(nèi)加標(biāo)準(zhǔn)液。靜置相同時(shí)間后，置37℃孵育14～16 h，取出，以游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑，按標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算血液標(biāo)本中的藥物濃度。

2.5 方法學(xué)研究[6]

2.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制備及最低檢測(cè)濃度：以正常人血清配制系列阿奇霉素標(biāo)準(zhǔn)液（濃度為 2.4、1.2、0.6、0.3、0.15、0.075、0.038、0.019、0.009和0.005 μg·mL－1），組間距1∶2，中心濃度為0.1 μg·mL－1，用磷酸鹽緩沖液（pH 7.8）和正常人血清各半作為稀釋液。測(cè)定抑菌圈，以血藥濃度的對(duì)數(shù)為縱座標(biāo)（Y），菌圈的直徑為橫座標(biāo)（X）進(jìn)行直線(xiàn)回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程Y＝0.12657X－0.30464（r＝9988））。結(jié)果表明，阿奇霉素檢測(cè)濃度在0.005～2.4 μg·mL－1濃度范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好。本法最低檢測(cè)濃度為0.005 μg·mL－1。

2.5.2 回收率試驗(yàn)：按照“2.5.1”項(xiàng)下方法，于空白血清中加入0.6、0.075、0.01875、0.005 μg·mL－14種濃度的阿奇霉素標(biāo)準(zhǔn)液，各配制若干份，按“2.4.4”項(xiàng)下方法操作，評(píng)價(jià)本法測(cè)定血清阿奇霉素含量的回收率。結(jié)果，4種濃度回收率分別為（109.29±9.44）%、（100.81±6.98）%、（110.06±3.24）%、（99.92±3.72）%。

2.5.3 精密度試驗(yàn)：按照“2.5.1”項(xiàng)下方法，于空白血清中加入0.6、0.075、0.01875、0.005 μg·mL－14種濃度的阿奇霉素標(biāo)準(zhǔn)液，各配制若干份，同日內(nèi)按“2.4.4”項(xiàng)下方法分別測(cè)定其抑菌圈，得出日內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差（RSD），并于日間按“2.4.4”項(xiàng)下方法測(cè)定并計(jì)算出日間RSD。精密度試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 精密度試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab 1 Results of precision test（n＝6）

2.5.4 凍融試驗(yàn)：將含藥血清反復(fù)冷凍（－20℃）、溶解，1周內(nèi)測(cè)定4次，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 凍融試驗(yàn)結(jié)果（n＝4）Tab 2 The result of frozen-melt test（n＝4）

3 結(jié)果

3.1 藥-時(shí)曲線(xiàn)

21名受試者交叉口服受試制劑1、受試制劑2或參比制劑各500 mg后的平均藥-時(shí)曲線(xiàn)見(jiàn)圖1。

3.2 數(shù)據(jù)處理

采用三交叉試驗(yàn)設(shè)計(jì)生物利用度計(jì)算和生物等效性分析程序（BIO3）計(jì)算機(jī)軟件，計(jì)算各個(gè)體的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，Cmax、tmax以實(shí)測(cè)值計(jì)算，AUC按梯形面積法計(jì)算。取值范圍0～144 h。采用各受試者的受試制劑與參比制劑的AUC0～144分別計(jì)算相對(duì)生物利用度（F），有關(guān)藥動(dòng)學(xué)參數(shù)見(jiàn)表3。

圖1 受試者口服3種制劑后平均藥-時(shí)曲線(xiàn)Fig 1 Mean plasma concentration-time curves of 3 kinds of preparations

3.3 生物等效性評(píng)價(jià)

對(duì)3組的AUC、Cmax數(shù)據(jù)均經(jīng)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后進(jìn)行方差分析表明，受試制劑1、試制劑2、參比制劑間均無(wú)差異；90%置信區(qū)間見(jiàn)表4，并作出生物等效性判定。另用非參數(shù)統(tǒng)計(jì)Krus-kall-Wallis法，判定tmax均無(wú)差異。

表3 受試者口服3種制劑后的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（n＝21）Tab 3 Comparison of pharmacokinetics parameters of three preparations（n＝21）

由表4判定結(jié)果：（1）受試制劑1的AUC0～144、Cmax與參比制劑的 AUC0～144、Cmax均生物等效；（2）受試制劑 2 的AUC0～144、Cmax與參比制劑的AUC0～144、Cmax均生物等效。

4 討論

表4 阿奇霉素膠囊拉丁方設(shè)計(jì)AUC、Cmax及其90%%置信區(qū)間Tab 4 AUC，Cmaxand their 90%%confidence interval of azihromycin capsule in Latin square design

阿奇霉素的體內(nèi)測(cè)定方法已有文獻(xiàn)報(bào)道[2，3，6]，有高效液相色譜（HPLC）-紫外法、HPLC-安培電化學(xué)檢測(cè)法、微生物法等。本文在現(xiàn)有試驗(yàn)條件下，以《中國(guó)藥典》為依據(jù)，采用經(jīng)典微生物法測(cè)定血清中阿奇霉素的濃度，經(jīng)方法學(xué)研究驗(yàn)證，回收率、日內(nèi)及日間精密度、靈敏度均能滿(mǎn)足臨床藥動(dòng)學(xué)及生物等效性研究的要求。

文獻(xiàn)報(bào)道，阿奇霉素因在其配基上的9位引入了一個(gè)甲基化的氮原子，使之具有獨(dú)特的藥動(dòng)學(xué)特點(diǎn)及廣譜的抗菌活性，即組織選擇性高、半衰期長(zhǎng)、對(duì)酸穩(wěn)定、口服比較容易吸收、生物利用度高，因此深受廠(chǎng)家、患者的青睞。本研究結(jié)果顯示，21例受試者單劑量口服500 mg阿奇霉素膠囊后，2種規(guī)格的阿奇霉素膠囊與參比膠囊在人體內(nèi)吸收、分布、消除較為一致，受試制劑1、受試制劑2相對(duì)于參比制劑的生物利用度分別為（102.73±15.63）%和（103.17±13.64）%，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析證明，兩兩間均無(wú)顯著性差異（P＞0.05），具有生物等效性。本試驗(yàn)為四川科創(chuàng)制藥有限公司研制的2種規(guī)格的阿奇霉素膠囊臨床應(yīng)用提供了依據(jù)。

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