馬來酸咪達(dá)唑侖片在漢族健康人體內(nèi)的藥動學(xué)研究Δ

郭濤，毛桂福，夏東亞，顏鳴，唐云彪（.沈陽軍區(qū)總醫(yī)院藥劑科，沈陽市 006；.沈陽藥科大學(xué)藥學(xué)院，沈陽市 006）

1 材料

1.1 儀器

高效液相色譜系統(tǒng)，包括600型四元泵、2487紫外檢測器（美國Waters公司）；AUW120D電子分析天平（日本島津公司）；PB-10 Sartorius普及型pH計（德國賽多利斯公司）；YKH-Ⅱ型液體快速混合器（江西醫(yī)療儀器廠）；KQ3200DE型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；TDL-5臺式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；L2199氮吹儀（北京來亨科學(xué)儀器公司）。

1.2 試藥

馬來酸咪達(dá)唑侖片（江蘇恩華藥業(yè)股份有限公司，規(guī)格：每片15 mg，批號：06052401）；馬來酸咪達(dá)唑侖標(biāo)準(zhǔn)品（中國藥品生物制品檢定所，批號：171250-200401，含量：100.0%）；內(nèi)標(biāo)：三唑侖標(biāo)準(zhǔn)品（中國藥品生物制品檢定所，批號：171250-200602，含量：100.0%）；甲醇、乙腈為色譜純，其余均為國產(chǎn)分析純，水為雙重蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2.1 受試者選擇

選擇漢族健康受試者10名，男、女各半，年齡（23±2）歲，體質(zhì)量（62.4±6.4）kg，身高（167±9）cm，體質(zhì)量指數(shù)（BMI）（22.5±2.3）kg·m－2。其父母、祖父母、外祖父母均為漢族婚配；試驗前進(jìn)行病史詢問和體格檢查，血常規(guī)、肝功、腎功等均正常；無藥物過敏史及藥物依賴史，無精神病史，不嗜煙、酒；試驗前15天未服用任何藥物；試驗期間禁煙、酒及含咖啡因的飲料。受試者在試驗前了解試驗?zāi)康?、方法、意義以及可能發(fā)生的不良反應(yīng)，并簽署知情同意書。

2.2 給藥方法

受試者試驗前1天進(jìn)食清淡晚餐后禁食12 h，試驗日晨空腹口服咪達(dá)唑侖片15 mg，用溫開水200 mL送服。服藥2 h后方可飲水，服藥4、10 h后進(jìn)食統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)餐。試驗期間避免劇烈活動。試驗方案經(jīng)沈陽軍區(qū)總醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

2.3 血樣采集

于服藥前0 h和服藥后0.33、0.67、1、1.5、2、2.5、3、4、6、9、12 h時分別由受試者前臂靜脈取血液5 mL，置肝素抗凝管中并搖勻，離心分離血漿，于－25℃冷凍保存。

2.4 血漿樣品處理

取血漿1.0 mL，加入內(nèi)標(biāo)溶液（40 ng·mL－1三唑侖溶液）50 μL和磷酸氫二鉀緩沖溶液0.2 mL，混勻后加入環(huán)己烷-三氯甲烷（4∶1）混合液4.0 mL，渦旋振蕩2 min，4000 r·min－1離心10 min，取上層有機(jī)相置5 mL離心管中，于55℃條件下用空氣吹干，殘渣加甲醇-10 mmol·L－1鹽酸（45∶55）混合溶劑80 μL 和正己烷50 μL，渦旋振蕩1 min，2500 r·min－1離心1 min，棄去上層有機(jī)相，取下層溶液20 μL進(jìn)樣。

2.5 色譜條件

色譜柱：Diamosil C18（200 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-乙腈-10 mmol·L－1醋酸銨溶液（pH 3.95）（50.2∶8∶41.8）；流速：1.1 mL·min－1；檢測波長：220 nm；柱溫：室溫；靈敏度為0.5AUFS。在該色譜條件下，混合空白血漿、混合空白血漿加馬來酸咪達(dá)唑侖對照品與內(nèi)標(biāo)、血漿樣品加內(nèi)標(biāo)分析結(jié)果表明，咪達(dá)唑侖與內(nèi)標(biāo)峰形良好，血漿內(nèi)源性雜質(zhì)、代謝物等不干擾樣品測定。色譜見圖1。

圖1 高效液相色譜圖A.空白血漿；B.空白血漿+馬來酸咪達(dá)唑侖對照品+內(nèi)標(biāo)；C.受試者的血漿樣品+內(nèi)標(biāo)；1.三唑侖；2.咪達(dá)唑侖Fig 1 HPLC chromatogramsA.blank plasma；B.blank plasma spiked with midazolam and IS；C.plasma sample spiked with IS；1.triazolam；2.midazolam

2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密量取系列濃度的對照品溶液各50 μL至8支具塞玻璃試管中，再加入空白血漿1 mL，使咪達(dá)唑侖血漿濃度分別為2.5、5.0、10.0、20.0、40.0、80.0、160.0、320.0 ng·mL－1，按“2.4”項下方法操作，進(jìn)樣測定，記錄色譜。以血漿樣品中待測物濃度（X）為橫坐標(biāo)，待測物與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值（Y）為縱坐標(biāo)，用加權(quán)（W＝1/C2）最小二乘法進(jìn)行回歸運(yùn)算，求得直線回歸方程：Y＝0.037X－0.010（r＝0.9980）。結(jié)果表明，咪達(dá)唑侖血藥濃度在2.5～320.0 ng·mL－1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。咪達(dá)唑侖血漿的最低定量濃度為2.5 ng·mL－1。

2.7 方法回收率

取空白血漿1 mL，加入適量對照品溶液，制備低、中、高（5.0、40.0、160.0 ng·mL－1）3種濃度的質(zhì)控樣品，按“2.4”項下方法操作，每一濃度測定5個樣本，計算方法回收率，結(jié)果見表1。

表1 方法回收率試驗結(jié)果（n＝5）Tab 1 Recovery test results（n＝5）

2.8 提取回收率和精密度

取空白血漿1 mL，加入適量對照品溶液制備低、中、高（5.0、40.0、160.0 ng·mL－1）3 種濃度的質(zhì)控樣品，按“2.4”項下方法操作，每一濃度測定5個樣本，計算方法的日內(nèi)精密度，低、中、高3種濃度的日內(nèi)RSD分別為15.5%、8.0%和4.9%。連續(xù)測定5 d，計算方法的日間精密度，低、中、高3種濃度的日間RSD分別為18.3%、10.2%和3.2%。另將測得的質(zhì)控血漿樣品的峰面積與相同濃度對照品溶液直接進(jìn)樣測得的色譜峰面積之比，計算提取回收率，結(jié)果低、中、高3種濃度的提取回收率分別為80.5%、80.0%、84.4%。

2.9 樣品穩(wěn)定性考察

取空白血漿1 mL，制備低、中、高（5.0、40.0、160.0 ng·mL－1）3種濃度的血漿樣品，分別在室溫、－25℃冰凍和凍融條件下存放。結(jié)果表明，咪達(dá)唑侖的血漿樣品在室溫放置8 h、－25℃冰凍14 d和反復(fù)凍融3次的條件下都是穩(wěn)定的。

2.10 藥-時曲線

10名受試者口服咪達(dá)唑侖片15 mg后，測得的平均藥-時曲線見圖2。

圖2 受試者單劑量口服咪達(dá)唑侖片15 mg后的平均藥-時曲線Fig 2 Mean plasma concentration-time curve of midazolam after administration of a single oral dose of 15 mg midazolam tablets in 10 healthy volunteers

2.11 藥動學(xué)參數(shù)

采用孫瑞元等編寫的DAS 2.0藥動學(xué)軟件對藥-時數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，以非室模型估算藥動學(xué)參數(shù)，采用梯形法計算AUC0～12，Cmax與tmax為實測值的平均數(shù)，結(jié)果詳見表2。

表2 受試者單劑量口服咪達(dá)唑侖片15 mg后的藥動學(xué)參數(shù)Tab 2 The pharmacokinetic parameters of midazolam after administration of a single oral dose of 15 mg midazolam tablets in 10 healthy volunteers

2.12 安全性評價

在整個試驗過程中，10名健康漢族受試者均未發(fā)生明顯不良反應(yīng)，表明受試者對單劑量口服咪達(dá)唑侖片有較好的耐受性。

3 討論

本文建立的HPLC法，以甲醇、乙腈和10 mmol·L－1醋酸銨溶液組成三元流動相，能消除代謝物與內(nèi)源性雜質(zhì)對咪達(dá)唑侖和內(nèi)標(biāo)的干擾，使最低定量濃度達(dá)到2.5 ng·mL－1，且各項指標(biāo)符合臨床藥動學(xué)研究的要求。

服藥30～60 min后，有9名受試者陸續(xù)入睡，2～4 h后陸續(xù)醒來，多數(shù)受試者不能回憶睡眠期間血樣采集的事情，這與咪達(dá)唑侖的作用特點相符。但1名女性受試者在整個試驗過程中未入睡，測定其血藥濃度后，發(fā)現(xiàn)有吸收滯后現(xiàn)象，且其濃度普遍較低。

漢族健康受試者單次口服15 mg咪達(dá)唑侖片劑后，tmax、t1/2分別與國內(nèi)文獻(xiàn)[1，3]報道相似。Cmax、AUC0～12分別與文獻(xiàn)[1]報道的（220.57±67.64）ng·mL－1和（587.86±161.65）ng·h·mL－1有較大差異，與文獻(xiàn)[3]報道的67.2～154.0 ng·mL－1及128～382 ng·h·mL－1相近。從表2看，各項藥動學(xué)參數(shù)都存在較大的個體差異，由于咪達(dá)唑侖的吸收和代謝過程都受到腸道、肝臟細(xì)胞色素P450（CYP）3A酶的催化代謝作用[5]，而遺傳、環(huán)境、生理等多種因素導(dǎo)致CYP3A酶活性可相差50倍[6]，因而導(dǎo)致了咪達(dá)唑侖藥動學(xué)過程的個體差異，臨床應(yīng)用時應(yīng)該注意個體化給藥。

7位受試者的藥-時曲線圖有雙峰現(xiàn)象，第1個峰出現(xiàn)在給藥后0.33～1 h，第2個峰出現(xiàn)在給藥后2～3 h。產(chǎn)生雙峰現(xiàn)象的機(jī)制主要與其松弛胃腸平滑肌，影響胃的排空有關(guān)[7，8]。國內(nèi)未見有關(guān)咪達(dá)唑侖片劑雙峰吸收現(xiàn)象的報道。

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