鉤藤堿對血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大的抑制作用

何 娜，孫安盛，吳 芹，黃燮南，石京山

(遵義醫(yī)學(xué)院1.藥理學(xué)教研室，2.貴州省基礎(chǔ)藥理重點實驗室，貴州遵義 563000)

心肌肥厚是發(fā)生心血管疾病的獨立危險因素，而心肌細(xì)胞肥大是心肌肥厚重要的細(xì)胞病理學(xué)基礎(chǔ)，闡明其發(fā)生及調(diào)控機制對心血管疾病的防治具有重要意義。鉤藤堿(rhynchophylline，Rhy)是常用中藥鉤藤〔Uncaria rhynchophylla(Miq.)Jackson〕中的主要生物堿，本研究室已報道鉤藤堿具有抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖、舒張血管和抗腦缺血再灌注損傷等作用［1－4］。降壓藥物若兼有抑制心肌肥厚的效應(yīng)，將能明顯增加其臨床應(yīng)用價值。本研究應(yīng)用體外培養(yǎng)的新生乳大鼠心肌細(xì)胞，研究Rhy對血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)所致心肌細(xì)胞肥大的影響，并探討其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物和試劑

新生SD乳大鼠，由第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院實驗動物中心提供，動物許可證:SCXK(軍)2007-017。Rhy，由廣西中藥研究所提供，高效液相法檢測純度為96%;AngⅡ和5'-溴脫氧尿苷(5-bromo-deoxyuridine，BrdU)購自Sigma公司;DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購自Gibco公司;鈣離子熒光探針Fluo-3/AM購自Biotium公司;RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、一氧化氮(nitric oxide，NO)和一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)測定試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所;β肌動蛋白、心房利鈉因子(atrial natriuretic factor，ANF)、鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(calcineurin，CaN)、細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶2(extracellular signal-regulated kinase 2，ERK2)和內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)引物購自大連寶生物公司，引物序列見表1;熒光定量PCR混和液購自英國ABI公司。

1.2 原代乳大鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)及給藥

無菌條件下取出生后1～3 d乳大鼠心臟，將心室在預(yù)冷的 D-Hank液中剪成1～3 mm3小塊，以0.125%的胰蛋白酶消化成細(xì)胞懸液，過濾，1000×g離心10 min，用含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液重懸浮，在37℃，5%CO2孵箱中差速貼壁 90 min后，取上清，細(xì)胞培養(yǎng)前 48 h加入終濃度為0.1 mmol·L－1BrdU抑制非心肌細(xì)胞增殖，然后換無胎牛血清的DMEM同步化24 h。制備的心肌細(xì)胞經(jīng)抗α肌動蛋白免疫組化鑒定，純度達95%以上，可用于實驗。實驗分為對照組(不含血清的DMEM培養(yǎng)基)、模型組(AngⅡ 0.1 μmol·L－1)和 Rhy 1，3 和10 μmol·L－1組(加入 Rhy 30 min 后加入 AngⅡ 0.1 μmol·L－1)，加入 Rhy 作用 48 h 后用于各指標(biāo)的檢測。

1.3 心肌細(xì)胞表面積的測量

將培養(yǎng)的心肌細(xì)胞以5×108L－1密度接種于含有蓋玻片的6孔板中，各組給予不同濃度的Rhy，48 h后進行HE染色，采用Leica Qwin V3圖像分析系統(tǒng)測量心肌細(xì)胞的表面積。隨機選取5個視野，每個視野隨機測定10～15個細(xì)胞，每組重復(fù)3次。

1.4 心肌細(xì)胞總蛋白質(zhì)含量的測定

心肌細(xì)胞以5×108L－1密度接種于24孔板中，各組加入不同濃度的Rhy，48 h后吸棄培養(yǎng)基，用PBS洗3次。加入RIPA裂解緩沖液后收集心肌細(xì)胞，冰浴下超聲破碎細(xì)胞，4℃，14 000×g離心30 min，取上清液按檢測試劑盒說明操作，計算每孔心肌細(xì)胞的蛋白質(zhì)含量。

1.5 心肌細(xì)胞［Ca2+］i測定

心肌細(xì)胞以1×108L－1密度接種于Petri皿中，各組加入 Rhy 0，1，3 和10 μmol·L－1，48 h 后無菌PBS洗3次，加入鈣離子探針Fluo-3/AM(終濃度為5 μmol·L－1)置于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵 45 ～60 min，PBS輕洗3次，加入培養(yǎng)基，采用激光共聚焦顯微鏡每組隨機選擇30個細(xì)胞進行動態(tài)掃描，通過分析軟件分析細(xì)胞內(nèi)鈣離子熒光強度。

1.6 細(xì)胞培養(yǎng)上清液NO含量和NOS活性的測定

心肌細(xì)胞以3×109L－1密度接種于25 ml無菌培養(yǎng)瓶內(nèi)，各組加入 Rhy 0，1，3 和 10 μmol·L－148 h后，收集細(xì)胞上清液，據(jù)NO和NOS測定試劑盒說明書測定NO含量和NOS活性。

1.7 實時熒光定量PCR檢測基因的表達

心肌細(xì)胞以3×109L－1密度接種于25 ml無菌培養(yǎng)瓶內(nèi)，Rhy組加入 Rhy 0，1，3 和10 μmol·L－1，培養(yǎng)48 h后按Trizol法提取心肌細(xì)胞總RNA，用紫外分光光度計于波長260 nm和280 nm檢測吸光度(A)，A260nm/A280nm值為 1.8 ～2.0。按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA并稀釋，進行PCR擴增。以β肌動蛋白為內(nèi)參基因，采用 2－ΔΔCt法計算ANF，CaN，ERK2和eNOS基因的相對表達水平。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

表1 熒光定量PCR基因擴增引物序列Tab.1 Primer sequences for PCR gene amplification

2 結(jié)果

2.1 鉤藤堿對血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大的影響

由表2 結(jié)果可見，AngⅡ 0.1 μmol·L－1使心肌細(xì)胞表面積增至對照組的2.8倍，蛋白質(zhì)含量增至1.4 倍(P ＜0.01)。Rhy 1，3 和 10 μmol·L－1顯著抑制AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞表面積增大和蛋白質(zhì)含量增加，對心肌細(xì)胞表面積的抑制率分別為50%，57%和61%(P＜0.01)，對蛋白質(zhì)含量的抑制率分別為7%，10%和23%(P ＜0.05，P ＜0.01)。實時熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示，正常心肌細(xì)胞ANF mRNA 基礎(chǔ)表達較低，AngⅡ 0.1 μmol·L－1組 ANF mRNA的表達增加至對照組的4.7倍(P＜0.01);Rhy 1，3 和10 μmol·L－1對 AngⅡ誘導(dǎo)的 ANF mRNA表達增加具有抑制作用，抑制率分別為42%，56%和66%(P ＜0.05，P ＜0.01)。

2.2 鉤藤堿對血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)心肌肥大細(xì)胞［Ca2+］i的影響

圖1和表3結(jié)果顯示，與對照組比較，AngⅡ0.1 μmol·L－1明 顯 增 加 心 肌 細(xì) 胞 ［Ca2+］i(P ＜0.01);與 AngⅡ組比較，Rhy 1，3 和 10 μmol·L－1顯著抑制［Ca2+］i增加隨Rhy濃度的增加，鈣離子熒光強度逐漸減弱，呈濃度依賴性，抑制率分別為15%，20%和28%(P ＜0.01)。

表2 鉤藤堿(Rhy)對血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)誘導(dǎo)心肌肥大細(xì)胞的表面積，蛋白質(zhì)含量和心房利鈉因子(ANF)mRNA表達的影響Tab.2 Effects of rhynchophylline(Rhy)on cell surface area，protein content，atrial natriuretic factor(ANF)mRNA of hypertrophic cardiomyocytes induced by angiotensinⅡ(AngⅡ)

圖1 鉤藤堿對血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)心肌肥大細(xì)胞胞內(nèi)游離鈣離子濃度(［Ca2+］i)的影響(Fluo-3熒光染色 ×400).心肌細(xì)胞處理見表2.A:正常對照組;B:AngⅡ0.1 μmol·L －1(模型)組;C:AngⅡ+Rhy 1 μmol·L －1;D:AngⅡ+Rhy 3 μmol·L －1;E:AngⅡ+Rhy 10 μmol·L －1組.Fig.1 Effect of rhynchophylline on concentration of intracellular free calcium(［Ca2+］i)of cardiomyocyte hypertrophy induced by angiotensinⅡ (Fluo-3 fluorescence staining ×400).

表3 鉤藤堿對血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)心肌肥大細(xì)胞內(nèi)［Ca2+］i的影響Tab.3 Effect of rhynchophylline on［Ca2+］ion angiotensinⅡ-induced hypertrophic cardiomyocytes

2.3 鉤藤堿對血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)心肌肥大細(xì)胞一氧化氮含量和一氧化氮合酶活性的影響

由表4可見，與正常對照組比較，AngⅡ 0.1 μmol·L－1降低心肌細(xì)胞NO含量和NOS活性(P＜0.01)。與 AngⅡ組比較，Rhy 1，3 和 10 μmol·L－1顯著促進心肌細(xì)胞NO的釋放，并升高NOS的活性(P ＜0.01);Rhy 10 μmol·L－1時，NO 含量和 NOS活性均為 AngⅡ組的2.3 倍(P ＜0.01)。

2.4 鉤藤堿對心肌細(xì)胞中鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶、細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶2和內(nèi)皮型一氧化氮合酶基因表達的影響

由表5結(jié)果可見，與正常對照組比較，AngⅡ0.1 μmol·L－1顯著增加 CaN 和 ERK2 mRNA的表達，降低NOS mRNA的表達(P ＜0.01);與 AngⅡ組比較，Rhy 1，3 和 10 μmol·L－1明顯抑制 CaN 和ERK2 mRNA 表達(P ＜0.05，P ＜0.01)，Rhy 3 和10 μmol·L－1明顯升高 NOS mRNA 表達;Rhy 10 μmol·L－1對CaN mRNA和ERK2 mRNA表達的抑制率分別為60%和42%，eNOS mRNA表達為AngⅡ組的2.3 倍(P ＜0.01)。

表4 鉤藤堿對一氧化氮(NO)含量和一氧化氮合酶(NOS)活性的影響Tab.4 Effects of rhynchophylline on content of nitric oxide(NO)and activity of nitric oxide synthase(NOS)on angiotensinⅡ-induced hypertrophic cardiomyocytes

3 討論

在心肌肥大形成的病理過程中，AngⅡ是重要的體液因子，可引起心肌細(xì)胞的肥大以及細(xì)胞間質(zhì)的堆積，從而導(dǎo)致心肌肥大［5］。現(xiàn)已普遍認(rèn)為AngⅡ是經(jīng)典的心肌細(xì)胞肥大的誘導(dǎo)劑。本研究采用AngⅡ為誘導(dǎo)劑，用HE染色觀察心肌細(xì)胞的形態(tài)，發(fā)現(xiàn)AngⅡ明顯增加心肌細(xì)胞體積、細(xì)胞腫脹和分界不清等肥大的病理改變;同時測得心肌細(xì)胞表面積和細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)含量明顯增加。近年研究還表明，ANF已被確認(rèn)為是心肌肥大的標(biāo)志［6］。本研究發(fā)現(xiàn)，AngⅡ還明顯增加ANF mRNA的表達，進一步證實本研究心肌細(xì)胞肥大模型建立成功。Rhy呈濃度依賴性地抑制AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞表面積和蛋白質(zhì)含量的增加，并抑制AngⅡ誘導(dǎo)的ANF mRNA表達，呈明顯抑制心肌細(xì)胞肥大的作用。

表5 鉤藤堿對血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)心肌肥大細(xì)胞鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(CaN)，細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶2(ERK2)和內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)基因表達的影響Tab.5 Effects of rhynchophylline on gene expressions of calcineurin(CaN)，extracellular signal-regulated kinase 2(ERK2)and endothelial nitric oxide synthase(eNOS)in angiotensinⅡ-induced hypertrophic cardiomyocytes

近年研究表明，心肌細(xì)胞［Ca2+］i增加是導(dǎo)致心肌肥大的最基本信號［7］，心肌細(xì)胞內(nèi)［Ca2+］i增高可激活 Ca2+敏感的 CaN，活化 T細(xì)胞核因子3(nuclear factor of activated T cells 3，NFAT3)和鋅指轉(zhuǎn)錄因子，進而活化多種心肌肥大相關(guān)基因如ANF等的表達，促進心肌肥大。NO可通過激活鳥苷酸環(huán)化酶而抑制L型Ca2+內(nèi)流，最終減弱NFAT核移位和轉(zhuǎn)錄活性而減輕心肌肥大。已有報道，NO能抑制心肌細(xì)胞和血管平滑肌的分裂和增殖，具有抗心肌肥大的作用［8－9］。Rhy 具有鈣通道阻滯作用［2］。本研究結(jié)果顯示，Rhy能明顯抑制AngⅡ作用下心肌細(xì)胞［Ca2+］i的升高，增強NOS的活性，促進NO的釋放，同時增加AngⅡ誘導(dǎo)的肥大心肌細(xì)胞eNOS mRNA的表達，抑制CaN mRNA的表達，表明其抗心肌細(xì)胞肥大作用可能與其抑制CaN通路有關(guān)。

絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)通路是AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大反應(yīng)的另一重要的胞內(nèi)信號傳導(dǎo)通路，主要包括ERK、c-Jun N端激酶/應(yīng)激活化蛋白激酶(c-Jun N-terminalkinase/stress activated protein kinase，JNK/SAPK)和MAPK p38。其中ERK1/2是重要的MAPK家族成員，也是細(xì)胞因子和生長因子介導(dǎo)細(xì)胞增殖中最重要的信號傳導(dǎo)途徑［10］。MAPK被其上游MAPK激酶ERK1/2磷酸化才具有活性，促進心肌細(xì)胞肥大。本研究表明，Rhy抑制了AngⅡ誘導(dǎo)的ERK2 mRNA表達，表明其抗心肌細(xì)胞肥大作用可能也與其抑制MAPK/ERK通路有關(guān)。

NO能抑制心肌細(xì)胞和血管平滑肌的分裂和增殖，具有抗心肌肥大的作用［7－8］。本研究結(jié)果顯示，Rhy能提高AngⅡ作用下心肌細(xì)胞NOS的活性，促進NO的釋放;同時增加AngⅡ誘導(dǎo)的肥大心肌細(xì)胞eNOS mRNA的表達，Rhy這一作用可能是其抗心肌細(xì)胞肥大的原因之一。

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