動物乳桿菌發(fā)酵液的體外抑菌試驗

羅 璠

（西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川 成都 610041）

乳酸菌分布廣泛，是存在于人、畜腸道中的一種有益微生物。許多乳酸菌都能產(chǎn)生有機酸、過氧化氫以及乳酸菌素等化合物，這些物質(zhì)在抑制多種病原微生物和食物腐敗菌等方面具有重要意義，不僅可抑制與其親緣關(guān)系相近的乳酸菌，而且對非乳酸菌的革蘭氏陽性細菌也具有一定的抑制作用。因此，乳酸菌在醫(yī)藥、食品及飼料工業(yè)中有著廣泛的應(yīng)用。

本試驗以分離自豬腸道的動物乳桿菌T12為試驗材料，測定其發(fā)酵液中各種化合物的抑菌效果，為開發(fā)新的食品添加劑及微生物飼料添加劑提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 樣品菌株 動物乳桿菌T12，分離自豬腸道，能夠產(chǎn)生乳酸菌素。

1.2 指示菌 大腸桿菌，鼠傷寒沙門氏菌，金黃色葡萄球菌，枯草芽孢桿菌，蠟狀芽孢桿菌，溶壁微球菌，黃曲霉，禾谷鐮刀霉，米曲霉，保加利亞乳桿菌，嗜酸乳桿菌，異常漢遜酵母。

以上菌株均由四川省資源微生物與微生物技術(shù)重點實驗室提供。

1.3 培養(yǎng)基 改良MRS培養(yǎng)基：大豆蛋白胨10.0 g，牛肉膏10.0g，酵母提取物5.0g，葡萄糖20.0g，乙酸鈉5.0 g，檸檬酸二胺 2.0 g，K2HPO42.0 g，MgSO4·7H2O 0.58g，Mn2SO4·H2O 0.25g，瓊脂 15.0g，蒸餾水 1.0L，pH值自然；牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。

2 試驗方法

2.1 發(fā)酵液制備 將保存的動物乳桿菌T12菌種接種到MRS液體培養(yǎng)基中，30℃活化24h，再轉(zhuǎn)入液體培養(yǎng)基中相同條件下培養(yǎng)48h，8000r/min離心，取發(fā)酵上清液放冰箱中備用。

2.2 發(fā)酵液pH值的測定 用pH儀準(zhǔn)確測定發(fā)酵液的pH值。

2.3 發(fā)酵液的抑菌譜研究 采用牛津杯法測定發(fā)酵液對各指示菌的抑菌作用，以未接種的MRS液體培養(yǎng)基為對照，每種指示菌做三次重復(fù)。

2.4 酸影響的排除及排酸后發(fā)酵液的抑菌效果 用乳酸調(diào) MRS液體培養(yǎng)基的 pH 值至 3.5、4.0、4.5、5.0、5.5和6.0，分別測定其對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌效果，確定對照pH值。

用1 mol/L NaOH和1 mol/L HCl將發(fā)酵液的pH值調(diào)至對照pH值，測定該發(fā)酵液對指示菌的抑制作用，每種指示菌做三次重復(fù)，以乳酸調(diào)MRS液體培養(yǎng)基至相同pH值為對照。

2.5 過氧化氫影響的排除及其對抑菌效果的影響H2O2對熱不穩(wěn)定，80℃水浴10 min可以完全除去H2O2。將除酸后的試驗菌株發(fā)酵液在80℃水浴10min，測定其抑菌譜。

3 試驗結(jié)果

3.1 發(fā)酵液的pH測定 用pH儀測定動物乳桿菌發(fā)酵液的pH值為3.69。

3.2 抑菌譜測定 采用牛津杯法測定動物乳桿菌T12發(fā)酵液對不同指示菌的抑制效果，結(jié)果表明，發(fā)酵液對革蘭氏陰性細菌及革蘭氏陽性細菌、乳酸菌均有一定的抑菌效果，對黃曲霉和米曲霉也有一定的抑制作用。詳見表1。

表1 發(fā)酵液的抑菌譜

3.3 排除酸影響后的發(fā)酵液的抑菌譜 乳酸對指示菌的抑制效果見表2。

從表2可以看出，乳酸在pH 4.5時對兩種指示菌的抑菌效果已經(jīng)很弱了，在pH 5.0時抑菌效果完全消失。根據(jù)參考文獻，選擇pH 5.0作為對照pH值。

調(diào)節(jié)發(fā)酵液的pH值至5.0后，發(fā)酵液的抑菌譜較調(diào)酸前有一定的變化，說明有機酸起到了一定的抑制作用。除酸后發(fā)酵液仍有抑菌效果，說明發(fā)酵液中除了有機酸還有其他抑菌物質(zhì)存在。根據(jù)研究報道，其中的乳酸菌素可能是重要的抑菌物質(zhì)之一。

表2 乳酸對指示菌的抑制效果

表2 排酸后發(fā)酵液的抑菌譜

3.4 除過氧化氫后的發(fā)酵液的抑菌譜 試驗結(jié)果顯示，除去過氧化氫后的發(fā)酵液的抑菌譜與除酸后的發(fā)酵液的抑菌譜沒有變化。說明過氧化氫在本試驗菌株的發(fā)酵液中沒有起到明顯的抑制作用。根據(jù)報道，過氧化氫有一定的抑菌作用，而在本試驗中沒發(fā)現(xiàn)其明顯的抑制作用，可能是因為它在發(fā)酵液中的含量較少，也可能是因為其他抑菌物質(zhì)的抑菌效果掩蓋了過氧化氫的抑制作用。

4 結(jié)論

乳酸菌的抑菌活性往往是其代謝產(chǎn)生的酸、過氧化氫及細菌素類物質(zhì)所產(chǎn)生的作用。本試驗所采用的動物乳桿菌T12的發(fā)酵上清液有較強的抑菌活性，在排除酸作用后，對指示菌仍有較強抑制作用，而過氧化氫的抑菌效果不明顯。說明動物乳桿菌產(chǎn)生的有機酸和乳酸菌素對多種微生物有明顯的抑制作用，兩者共同作用的抑菌效果明顯強于乳酸菌素的單獨作用。過氧化氫在此次試驗中的抑菌作用不明顯。

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