脂多糖對(duì)不同發(fā)育期小鼠肝臟β-防御素3表達(dá)的影響＊

羅詠梅 鄭筠

(1.四川省建筑醫(yī)院藥劑科,四川 成都 610041;2.中國醫(yī)藥集團(tuán)總公司四川抗生素研究所,四川 成都 610041)

當(dāng)機(jī)體受到外界病原微生物、炎癥因子以及細(xì)胞因子刺激時(shí),會(huì)激活天然免疫系統(tǒng)產(chǎn)生內(nèi)源性抗生素肽(Endogenous antibiotic peptide),簡稱抗菌肽。而作為抗菌肽家族成員之一的防御素,是一類小分子陽離子多肽,分子量在3000-4500 Da之間。根據(jù)其分子結(jié)構(gòu)主要分為三類：α-,β-,θ-防御素。它們具有廣譜的抗微生物作用,對(duì)大多數(shù)的革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、真菌、流感病毒以及 HIV等等,均有明顯的殺傷或抑制作用[1-3]。小鼠防御素,包括隱凹素(α-防御素)(Cryptdin)以及β-防御素,目前發(fā)現(xiàn)并已經(jīng)成功克隆的小鼠β-防御素主要包括mBD-1、-2、-3、-4、-5、-6、-7、-8、-9、-11、-12、-13、-14以及-35[4-7]。mBD-1是一種廣泛存在于不同上皮的抗菌肽,在腎中的表達(dá)量最高,LPS不能誘導(dǎo)其表達(dá),其與人β-防御素1同源性最高[4];mBD-3在食管、氣管以及舌中具有固有表達(dá),經(jīng)LPS或是革蘭氏陰性菌感染可在肝、胃腸道以及肺中誘導(dǎo)表達(dá),其與人β-防御素2在結(jié)構(gòu),功能上相似性最高[5];mBD-4在舌、食管以及氣管的上皮中固有表達(dá)量最高,氣管給予銅綠假單胞菌PAO1注射后,未發(fā)現(xiàn)其在肺內(nèi)表達(dá)量有明顯改變,但是并不代表其它的刺激物無法引起本身的誘導(dǎo)表達(dá),其與人β-防御素2在蛋白序列及功能上也具有較高的相似性[6]。

由于小鼠防御素與人防御素之間存在很多的共通之處,所以小鼠防御素成為了研究防御素功能以及作用機(jī)制的主要對(duì)象。對(duì)于人防御素在發(fā)育過程中起到的關(guān)鍵作用,以往的文獻(xiàn)中提到β-防御素以及抗菌肽其他家族成員LL-37在肺部的發(fā)育過程中起到的重要保護(hù)作用[7],以及在新生兒肺部感染中防御素起到的重要的防御作用[8],但是迄今為止,鮮有文獻(xiàn)報(bào)道防御素在其他重要器官發(fā)育過程中的關(guān)鍵作用。通過本文的研究,了解小鼠防御素mBD-3在正常以及受到LPS感染的不同發(fā)育時(shí)期小鼠肝臟的表達(dá)情況,為進(jìn)一步研究防御素在胎兒及新生兒感染方面提供依據(jù),也為進(jìn)一步探索防御素在天然免疫中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

健康5周齡ICR小鼠,購自簡陽達(dá)碩動(dòng)物中心。T rizol試劑(Invitrogen,USA),其余試劑均來購自成都寶信生物技術(shù)公司。二步法 RT-PCR試劑盒(Tiangen,Japan)。RT-PCR試劑盒,PCR mix試劑購自北京天根公司。一抗：anti-mBD-3(Santa Cruz,USA);anti-β-actin(Santa Cruz,USA)。BCA 蛋白試劑盒(pierce,USA);ECL發(fā)光試劑盒購自北京奧科生物技術(shù)有限公司。顯影液,定影液以及膠片購自柯達(dá)公司。牛血清白蛋白(BSA)(Sigma,Japan);Tween-20、2-巰基乙醇(Sigma,USA),其余用品均為國產(chǎn)分析純;小鼠SP檢測試劑盒購自成都寶信生物技術(shù)公司。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的準(zhǔn)備

健康ICR小鼠,5～6周齡,飼養(yǎng)于定溫空調(diào)房內(nèi),早晨定時(shí)給水及飼料。使用注射器腹腔注射雌鼠PMSG 5 U?只-1,再42-48 h后注射 HCG 10 U?只-1。雌鼠：雄鼠按 2∶1的比例合籠。定時(shí)熄燈,于晚上12時(shí)觀察交配情況。翌日,檢查雌鼠陰道是否有白色陰栓出現(xiàn),見陰栓的雌鼠單獨(dú)飼養(yǎng),此時(shí)為0.5 d。妊娠雌鼠隨機(jī)分組,每組50只,按日待用。

1.2.2 LPS注射建立小鼠模型

LPS感染組(n=50)孕鼠(E13.5、E16.5)經(jīng)腹腔注射550μg?kg-1LPS,24 h 后,取母鼠、胎鼠(E14.5、E17.5)的肝臟備用,在孕期17.5 d的孕鼠注射550μg?kg-1LPS,取新生鼠(P0、P4)的肝臟備用,新生鼠成年后(三周齡)取肝臟備用;正常對(duì)照組(n=50)同時(shí)間注射同量的生理鹽水,同時(shí)間取小鼠肝臟備用。

1.2.3 RT-PCR檢測不同發(fā)育期小鼠肝臟mBD-3 mRNA表達(dá)

按Trizol法提取肝臟總RNA。按照北京天根公司試劑盒說明書,將 RNA反轉(zhuǎn)錄為 cDNA,以β-actin作為內(nèi)對(duì)照。反應(yīng)體系中加入 25 μ l 2 ×mRNA selective PCR buffer I,1 μ l Rnase inhibitor,10 μ l M gCl2,5 μ l dNTP,1 μ l AMV taq,補(bǔ)齊體 積為50 μ l。程序如下：42℃,40min;94℃預(yù)變性 2min;94℃變性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸45 s,30個(gè)循環(huán);最后72℃延伸7min。反應(yīng)結(jié)束后取5 μ l PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳觀察。引物序列如下：

基因 上游引物 下游引物 片段長度(bp)mBD-3 5'-CTCTTTGCATTTTCC TGGTG-3'5'-GGGAGCACTGTTTGC ATTT-3' 235 β-actin 5'-AACCCTAAGGCCAAC CGTG-3'5'-CAGGATTCCATACCC AAGAAGG-3' 650

1.2.4 Western-blotting檢測不同發(fā)育期小鼠肝臟mBD-3蛋白表達(dá)

不同發(fā)育時(shí)期的肝臟蛋白提取步驟按南京凱基公司蛋白提取試劑盒說明書進(jìn)行,簡要程序如下：按組織凈重∶裂解液=1∶10的比例,制備組織勻漿液。室溫靜置 10min,離心10,000 rpm×10min,棄上清,室溫10min空氣干燥沉淀。所得蛋白,按BCA蛋白濃度測定試劑盒(Pierce)說明書方法測定蛋白濃度。T ricine-SDS-PAGE電泳分離不同的蛋白條帶,12 V 4℃冰箱濕轉(zhuǎn)過夜。取出PVDF膜,一抗孵育：將對(duì)應(yīng)抗體按1(200用一抗稀釋液稀釋后(總體積為 5ml),加入雜交袋中,4℃雜交袋內(nèi)孵育過夜。移去一抗孵育液,用足量TBST洗液振蕩洗滌3×10min。二抗孵育：將HRP標(biāo)記的二抗(羊抗兔IgG)按1∶5000用封閉液稀釋(總體積為5ml),加入雜交盒內(nèi),室溫振蕩孵育1 h。移去二抗孵育液,用足量 TBST洗液振蕩洗滌3×10min。PVDF膜浸到ECL化學(xué)熒光試劑中顯色,然后定影,顯影。

1.2.5 免疫組化

不同發(fā)育時(shí)期的左半葉肝臟取出后,用0.1 mol?L-1磷酸鹽緩沖液(PBS)洗凈血跡,置于0.1%DEPC的4%多聚甲醛溶液中固定,30%乙醇 15min,50%乙醇 15min,75%乙醇15min,85%乙醇15min,95%乙醇10min(2次),100%乙醇10min(2次)梯度脫水,乙醇二甲苯(1∶1)15min,二甲苯5-10min,二甲苯石蠟(1∶1)15min,浸蠟1 h(3次),石蠟包埋。載玻片用APES防脫片劑處理,撈片后置烤箱58～60℃孵育30～60min;切片梯度無水乙醇以及二甲苯常規(guī)脫蠟;30%H2O2滴在切片上,室溫5～10min滅活內(nèi)源性酶,蒸餾水洗3次;熱修復(fù)抗原：將切片浸入0.01 M枸櫞酸鹽緩沖液(PH6.0),微波爐加熱間隔5～10min后,反復(fù)1～3次,冷卻后用磷酸緩沖液(PBS)(PH7.2～7.6)洗滌1～2次;滴加5%山羊血清封閉液,室溫孵育20min;滴加適當(dāng)稀釋的相對(duì)應(yīng)的一抗,放入濕盒中,4℃過夜,取出后PBS洗2min×3次。滴加生物素化二抗,20～37℃30min,PBS洗2min×3次;滴加新鮮配制的三抗,20～37℃20min,PBS洗5min×4次;滴加新鮮配制的DAB溶液顯色。蘇木素輕度復(fù)染30 s,梯度無水乙醇脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片。上述染色均設(shè)陽性對(duì)照片和陰性對(duì)照片,陽性對(duì)照片為已知切片,陰性對(duì)照片為PBS替代一抗,顯微鏡觀察,陽性結(jié)果為胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒。

1.2.6 免疫組化結(jié)果判定

每張切片隨機(jī)選10個(gè)視野,高倍鏡下(×400)以細(xì)胞漿或膜出現(xiàn)定位清晰的淡黃色至棕褐色顆粒狀物質(zhì)為陽性。根據(jù)陽性細(xì)胞膜或漿的染色程度及染色細(xì)胞百分率評(píng)分,行半定量分析：根據(jù)陽性細(xì)胞比例以及染色的細(xì)胞水平進(jìn)行半定量分析。每個(gè)抗原的表達(dá)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為：0分：無染色;1分：弱染色;2分：強(qiáng)染色占到25%或中度染色＜80%;3分：強(qiáng)染色占到25%-50%或是中度染色＞80%;4分：強(qiáng)染色＞50%。每種情況,要計(jì)算10個(gè)最具有代表性的視野的比值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 mBD-3 mRNA在不同發(fā)育期小鼠肝臟表達(dá)

RT-PCR結(jié)果顯示：正常對(duì)照組中,mBD-3 mRNA在肝臟中的表達(dá)量微弱至無法檢測到,僅在出生后第四天檢測到較弱的表達(dá)。而mBD-3在 LPS誘導(dǎo)后原未見基礎(chǔ)有表達(dá)的肝臟出現(xiàn)誘導(dǎo)表達(dá),隨著發(fā)育天數(shù)的增加,胎鼠、新生鼠以及成年鼠的肝臟的誘導(dǎo)表達(dá)逐漸的增強(qiáng),在成年后受感染,肝臟的mBD-3表達(dá)量達(dá)到最高。這說明在發(fā)育過程中,胎鼠受到感染后的防御能力在逐漸增強(qiáng)(圖1)。

圖1 不同發(fā)育時(shí)期小鼠肝臟mBD-3 mRNA表達(dá)電泳圖

2.2 mBD-3蛋白不同發(fā)育期小鼠肝臟表達(dá)以及在肝臟中的分布

Western blotting結(jié)果顯示：mBD-3蛋白在肝臟中的表達(dá)趨勢與其RNA的表達(dá)趨勢基本一致。正常對(duì)照組同樣未檢測到mBD-3蛋白表達(dá),而在LPS感染組,mBD-3出現(xiàn)了誘導(dǎo)表達(dá),且隨著發(fā)育天數(shù)的增加,胎鼠、新生鼠以及成年鼠的肝臟中mBD-3誘導(dǎo)表達(dá)逐漸的增強(qiáng),這種表達(dá)在小鼠成年后的肝臟中達(dá)到最高(圖2)。

圖2 不同發(fā)育時(shí)期小鼠肝臟mBD-3蛋白表達(dá)電泳圖

在小鼠肝臟發(fā)育過程中,正常對(duì)照組中,未發(fā)現(xiàn)明顯表達(dá)mBD3的陽性細(xì)胞,但是在肝細(xì)胞漿中有零星的陽性表達(dá),且隨著發(fā)育時(shí)間的增加,這種零星表達(dá)分布逐漸增多(圖 3 A、C、E、G、I)。而在LPS感染組,在肝細(xì)胞索以及肝細(xì)胞內(nèi)部及肝血竇中均發(fā)現(xiàn)大量的mBD3陽性表達(dá)細(xì)胞,尤其是在庫夫氏細(xì)胞胞漿內(nèi)這種陽性表達(dá)尤其明顯,且隨著發(fā)育時(shí)間的增加,陽性細(xì)胞量逐漸的增多,分布也逐漸的變廣。胚胎發(fā)育中期14.5天,經(jīng)過LPS誘導(dǎo)在肝臟組織中有較明顯的mBD-3表達(dá)(圖 3 B),到胚胎晚期,第 17.5天時(shí),小鼠胚胎發(fā)育成熟,接近成鼠水平(圖3 D),在LPS感染組的表達(dá)最高(圖3 F、H、G)。LPS感染組的陽性表達(dá)明顯高于正常對(duì)照組(圖3),組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。

3 討論

母體感染LPS對(duì)母體本身危害極大,也是導(dǎo)致胎兒的宮內(nèi)死亡,早產(chǎn),宮內(nèi)發(fā)育遲滯,早發(fā)性爆發(fā)性新生兒肺炎及死亡的重要原因之一。防御素則具有抵抗LPS感染的功能,同時(shí)鼠的β-防御素同人β-防御素有許多相似的地方,比如廣泛存在于多種器官組織上皮,有廣譜的抗微生物作用,也有固有表達(dá)和誘導(dǎo)表達(dá)兩種方式,同人防御素HBD-2一樣都位于小鼠第8號(hào)染色體上的特點(diǎn)。基于同源性、上游調(diào)控元件、表達(dá)方式的共通性,所以本實(shí)驗(yàn)選擇了mBD-3來觀察LPS刺激后不同發(fā)育時(shí)期小鼠肝臟β-防御素表達(dá)的差異。本實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)就在于研究LPS感染對(duì)胎鼠、新生鼠以及成年鼠產(chǎn)生防御性β-防御素的影響,從而對(duì)于人β-防御素對(duì)抗孕期LPS感染提供借鑒性的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1999年,小鼠β-防御素 3(mBD-3)被成功克隆出來,其cDNA序列同HBD-2具有36.7%的同源性,同 HBD-1僅有25.3%的同源性。其氨基酸序列同HBD-2的相似序列達(dá)到了39.7%。mBD-3序列由兩個(gè)外顯子將1.7 kb長的內(nèi)含子分開,在其5'端側(cè)翼鏈含有 TATA盒以及 NF-κ B的同源結(jié)合序列。通過原位雜交的方法檢測的結(jié)果發(fā)現(xiàn),骨骼肌未檢測到表達(dá),在唾液腺、胰腺以及生殖道(睪丸)上皮發(fā)現(xiàn)mBD-3的高表達(dá)。在腦、肝、肺、卵巢均有表達(dá),在胚胎發(fā)育 7天就有表達(dá),在11天時(shí)達(dá)到最高,后在胚胎15天表達(dá)又有所下降。后經(jīng)氣管注射綠膿桿菌PAO1,再使用RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)在肺、小腸以及肝中的表達(dá)量迅速增高。在肝臟的表達(dá),在以后的研究中發(fā)現(xiàn)LPS感染可導(dǎo)致肝臟的急性相反應(yīng),產(chǎn)生大量的mBD-3。在2002年的研究中,結(jié)果顯示 mBD-3在舌、肺、心、肝、腎、脾以及陰莖、骨骼肌都沒有發(fā)現(xiàn)基礎(chǔ)表達(dá)。但是在使用革蘭氏陰性菌感染以后,發(fā)現(xiàn)其在舌、食管、肺、肝以及小腸的表達(dá)增加了[5]。后期研究發(fā)現(xiàn)mBD-3,mBD-4以及mBD-6在多種組織中均能檢測到,如食管、舌和氣管,附睪組織以及骨骼肌中均有發(fā)現(xiàn),而利用ICR小鼠,腹腔注射 LPS后,利用RT-PCR可檢測到肺內(nèi)的 mBD-3以及 mBD-6表達(dá)增加[6]。

而本實(shí)驗(yàn)在前人研究的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步探討了mBD-3在小鼠不同發(fā)育時(shí)期肝臟的表達(dá)及LPS感染對(duì)其在肝臟發(fā)育期中表達(dá)的影響。肝臟發(fā)育的關(guān)鍵階段為第15-16天,此時(shí)基本形成成年肝臟,且共有四個(gè)肝葉,即是左、右、中和尾葉。在正常情況下,肝臟并未檢測到mBD-3的基礎(chǔ)表達(dá),而在LPS刺激下,mBD-3展示了其誘導(dǎo)表達(dá)的特性。通過RT-PCR以及Western blotting檢測其在肝臟不同發(fā)育時(shí)期的基因及蛋白的表達(dá)變化,以及免疫組化檢測其分布。結(jié)果顯示在肝臟的各發(fā)育階段mBD-3誘導(dǎo)表達(dá)均約有60%以上的增加,而這種增加的趨勢,隨著小鼠的發(fā)育而不斷的增強(qiáng)。這種現(xiàn)象可能與鼠的β-防御素基因上游序列炎癥反應(yīng)元件組成或類型有關(guān)。mBD-35'側(cè)翼端具有 NF-κ B以及 IL-6、AP-1反應(yīng)元件,而這些元件正是人β-防御素發(fā)生誘導(dǎo)表達(dá)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄元件,提示我們LPS很有可能通過這些反應(yīng)元件來調(diào)控mBD-3誘導(dǎo)表達(dá)。而且隨著發(fā)育天數(shù)的增加,在受到外界刺激的時(shí)候,小鼠肝臟誘導(dǎo)防御素的能力逐漸增強(qiáng),而且從免疫組化的結(jié)果看來陽性細(xì)胞分布的范圍也較廣,這說明在小鼠發(fā)育的過程中,肝臟在受到感染時(shí),防御的能力隨著器官分化的逐步增加,而逐漸的增高,但在這其中各種反應(yīng)元件如何發(fā)揮作用以及在其他組織的mBD-3的基礎(chǔ)表達(dá)及誘導(dǎo)表達(dá)的變化趨勢,將是我們進(jìn)一步需要實(shí)驗(yàn)研究的問題。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明不同發(fā)育時(shí)期小鼠的肝臟在正常情況下,均未見mBD-3的表達(dá),但是在LPS感染情況下,小鼠肝臟大量表達(dá)mBD-3,且隨著小鼠發(fā)育的天數(shù)的增加,其誘導(dǎo)表達(dá)逐漸增加,提示該分子在肝臟組織發(fā)揮天然免疫防御作用中占據(jù)重要的地位。

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