Ⅱ型糖尿病動物模型研究進展＊

牟道華 譚正懷

(1.成都中醫(yī)藥大學,四川 成都 610072;2.四川省中醫(yī)藥科學院,四川 成都 610041)

著人們生活習慣、生活方式的改變,肥胖的人越來越多。與之伴隨的是Ⅱ型糖尿病的發(fā)病率迅速增加。1980年全國l3省及北京市30萬人口進行的糖尿病調(diào)查中,糖尿病患病率為0.609%。在不到30年后的2008年,全國14省市糖尿病和代謝綜合征的患病率調(diào)查顯示,我國糖尿病患病率達到9.6%,增加超過了15倍。換言之,目前我國糖尿病患病人數(shù)已經(jīng)超過7千萬[1]。

Ⅱ型糖尿病又稱非胰島素依賴型糖尿病(Non-insulin dependent diabetes mellitus,NIDDM),其特點為胰島素抵抗、胰島素分泌受損、空腹高血糖或餐后2 h高血糖。由于Ⅱ型糖尿病及其并發(fā)癥的迅速蔓延已經(jīng)成為嚴重威脅人類健康的世界性難題,為了找到能有效防治糖尿病及其并發(fā)癥的藥物或方法,相關(guān)動物模型則是其必不可少的重要工具。目前常用的Ⅱ型糖尿病的動物模型主要分為誘導性動物模型、自發(fā)性動物模型和轉(zhuǎn)基因動物模型?，F(xiàn)將相關(guān)研究進展綜述如下：

1 誘導性Ⅱ型糖尿病動物模型

Ⅱ型糖尿病的發(fā)病與外界環(huán)境以及食物等因素密切相關(guān),多數(shù)情況為多因素致病,如過量的能量攝入往往會加重胰島的負荷致使胰島功能受損,或胰島功能本來就不足,加上食物的誘導,致使胰島的分泌往往不能滿足機體的需要,導致血糖升高。

1.1 食物誘導的糖尿病動物模型

食物誘導的Ⅱ型糖尿病動物模型與人類的發(fā)病情況類似,在新藥開發(fā)、發(fā)病機理研究中具有極大的應用價值。許多動物都可通過食物誘導產(chǎn)生胰島素抵抗、血糖升高甚至Ⅱ型糖尿病,但能夠用于實驗的動物主要有以下幾種：

BDF1小鼠：該小鼠是用C57BL/6小鼠和DBA/2小鼠雜交繁殖而成,在此基礎(chǔ)上,再喂以高脂飼料而培育出的肥胖型Ⅱ型糖尿病小鼠。該小鼠在喂以高脂飼料后,體重增長迅速,在第3～4個月時出現(xiàn)高血糖、糖尿和HbA1C升高等糖尿病癥狀。其糖耐量已明顯受損,體外胰島培養(yǎng)顯示胰島素含量降低,且胰島素分泌對高濃度葡萄糖刺激不敏感[2]。

沙鼠：沙鼠生活在食物來源比較匱乏的草原和沙漠地區(qū),常以灌木的葉子和種子為食。食物所含能量很少,但能保持健康,既不出現(xiàn)肥胖也無糖尿病發(fā)生。若給予標準熱量實驗室飼料4個月,會有部分沙鼠出現(xiàn)典型的代謝綜合征癥狀群(肥胖、胰島素抵抗、Ⅱ型糖尿病和血脂紊亂)。若給予高能飼料1周,沙鼠則會出現(xiàn)高胰島素血癥,胰島β細胞體積減為原來的

1/3,這些現(xiàn)象均與血糖濃度有密切的關(guān)聯(lián)。沙鼠總是先出現(xiàn)高胰島素血癥,再出現(xiàn)高血糖,最終出現(xiàn)不可逆的糖尿病狀態(tài)[3]。最近研究發(fā)現(xiàn),在沙鼠動脈壁及血管平滑肌細胞有脂肪生成,其動脈壁脂類沉積和脂肪生成無關(guān)[4]。沙鼠的高脂血癥并不是由于腸道吸收太多的脂類,而是因為糖尿病狀態(tài)本身而引起的[5]。

尼羅河大鼠：用常規(guī)飼料喂養(yǎng)尼羅河大鼠后,該鼠首先出現(xiàn)高胰島素血癥,高血糖,不久后出現(xiàn)了高甘油三脂,高膽固醇,高血壓。若用高脂飼料喂養(yǎng)則上述癥狀將會更早出現(xiàn)。研究發(fā)現(xiàn)這種大鼠糖尿病的出現(xiàn)是由于基因與飲食交互作用導致的[6]。

1.2 飲食誘導與STZ聯(lián)合應用

對于一般動物而言,單純用食物誘導成糖尿病往往會需要很長的時間,不宜作為研究對象。為縮短成模時間,人們往往采用復合的方法復制模型,如采用高脂飼料先將動物誘導肥胖、產(chǎn)生胰島素抵抗,在此基礎(chǔ)上再通過不同方法進一步損傷胰島功能,使血糖進一步升高,最終導致糖尿病癥狀出現(xiàn)。Zhang等用高脂飼料喂養(yǎng)大鼠 4 w后,再腹腔注射STZ 30 mg?kg-1兩次,便可造成穩(wěn)定的Ⅱ型糖尿病動物模型[7]。Sahin給予SD大鼠飼喂特殊制備的高脂飼料2 w后,腹腔注射40 mg?kg-1的STZ,出現(xiàn)典型Ⅱ型糖尿病癥狀。Wang等用含有20%蔗糖和10%豬油的高脂飼料飼養(yǎng)4 w后一次性注射劑量為30 mg?kg-1的STZ,通過測定每組大鼠的體重增長曲線、血糖水平、膽固醇、血甘油三酯水平等指標顯示STZ加高脂飼料組的糖尿病特征極其明顯。這種模型往往具有會出現(xiàn)胰島素抵抗、高血糖等Ⅱ型糖尿病的特征,但常不會出現(xiàn)高胰島素,因此該類模型可能不適宜于胰島素增敏劑的研究。

2 自發(fā)性Ⅱ型糖尿病動物模型

遺傳因素在Ⅱ型糖尿病的發(fā)生、發(fā)展中起著非常重要的作用,為深入研究其發(fā)病機理,人們通過多種途徑開發(fā)出多種可以用于研究的遺傳性Ⅱ型糖尿病動物模型。目前主要包括：db/db小鼠、ob/ob小鼠、NSY小鼠(Nagoya-Shibate-Yasuda mice,NSY mice),Zucker fa/fa與ZDF大鼠(Zucker diabetic fatty)大鼠、GK 大鼠(Goto-Kakisaki,GK)、OLETF(Otsuka Long-Evans Tokushima Fatty,OLETF)大鼠等。

2.1 db/db小鼠

由C57BL/KsJ近親交配株常染色體隱性遺傳衍化而來,屬Ⅱ型糖尿病模型。由于不正常的剪接,使終止密碼子過早的插入從而使長鏈瘦素受體Ob-Rb被替換成了短鏈瘦素受體Ob-Ra。因為Ob-Rb受體負責瘦素在下丘腦的調(diào)節(jié)食欲,體重,能量消耗的作用,缺乏Ob-Rb受體就會導致肥胖,盡管血清瘦素水平升高。在4周齡時,db/db小鼠糖耐量正常,便在8周齡時便會產(chǎn)生嚴重的糖尿病且會和ob/ob小鼠一樣的肥胖。在大多數(shù)研究中,均發(fā)現(xiàn)db/db小鼠有早期的高胰島素血癥,血清脂肪酸和甘油三酯升高。動物在一個月時開始貪食及發(fā)胖,繼而產(chǎn)生高血糖、高血胰島素,胰高血糖素也升高,一般在10個月內(nèi)死亡。db/db小鼠心臟收縮功能比ob/ob小鼠有更加明顯的損傷,這可能是由于早期高血糖的原故。該小鼠會發(fā)生左心室擴大,心肌壁增厚,顯示出明顯的心肌肥大,心臟舒張功能也受損,可能是由于脂肪酸誘導的線粒體解耦聯(lián)所致。db/db小鼠心肌線粒體超氧化物、丙二醛和4-羥基壬烯醛水平升高提示db/db小鼠心肌存在著氧化應激。心臟交感神經(jīng)激活和副交感神經(jīng)張力降低顯示心肌自律神經(jīng)紊亂[8]。

2.2 ob/ob小鼠

屬常染色體隱性遺傳Ⅱ型糖尿病動物。由于ob/ob小鼠瘦素基因突變,導致瘦素缺乏,C57BL/6 ob/ob小鼠4周齡時發(fā)生輕度肥胖,表現(xiàn)出了高胰島素血癥和糖耐量受損,但沒有形成糖尿病。在第15周齡時ob/ob小鼠才發(fā)生嚴重的肥胖和糖尿病。某些ob/ob小鼠血清甘油三酯和脂肪酸水平升高,這取決于它的營養(yǎng)狀態(tài)和年齡。除了攝食過量外,ob/ob小鼠還表現(xiàn)出體溫下降,身體脂肪含量增加,能量消耗和活動度降低,不育或不孕,大約14月齡時死亡。研究表明ob/ob小鼠心肌收縮功能沒有或者僅輕微的損傷,但舒張功能有明顯紊亂,使心臟整體功能有一定的降低。當其心臟暴露于高濃度的脂肪酸中時,脂肪氧化和甘油三脂儲存增加,葡萄糖氧化降低,心肌胰島素抵抗加強。心肌線粒體呼吸容量減少并伴隨著各種底物、ATP合酶解耦聯(lián)。糖尿病ob/ob小鼠肝PPA RY2表達水平升高與胰島素抵抗有關(guān)?？诜仆蛩猁}(Estrone sulfate)可降低ob/ob小鼠肝葡萄糖-6-磷酸酶的活性和酶蛋白的水平,從而使血糖正常。研究發(fā)現(xiàn)它們和人類Ⅱ型糖尿病不同的是不具有血液的高凝狀態(tài),因此不能用于糖尿病心血管和腦血管并發(fā)癥方面的研究[9]。

2.3 NSY小鼠

是從遠交系JCl/ICR小鼠中選擇葡萄糖耐量異常株培育而成的,其糖尿病發(fā)生與年齡、性別密切相關(guān)：24周齡時胰島素分泌功能嚴重受損,48周齡的累積發(fā)病率雄性為98%,雌性為31%。此鼠在任何年齡階段都不表現(xiàn)嚴重肥胖和顯著的高胰島素血癥,胰島也無腫大或炎性變化,研究發(fā)現(xiàn)染色體Chr11和Chr14共同影響NSY小鼠高血糖和肥胖,而其中單獨的一個染色體卻對血糖和肥胖無任何影響[10]。

2.4 ZDF(Zucker diabetic fatty)大鼠

Zucker fatty rat大鼠基因編碼的瘦素受體發(fā)生了純合子錯義突變。這種突變發(fā)生在Fa基因序列中,導致Ob-R功能缺失。Zucker diabetic fatty大鼠起源于Zucker fatty rat選擇育種,即選出其中血糖高者。因此Zucker diabetic fatty大鼠產(chǎn)生于Zucker fatty rat遠交系的近交系品種。ZDF大鼠發(fā)生肥胖,高胰島素血癥,高血糖,高瘦素,以及高血清甘油三酯和脂肪酸,在第6周齡時便出現(xiàn)胰島素抵抗。高血糖開始于第6周前后,在10到12周時出現(xiàn)穩(wěn)定的高血糖,血清胰島素水平開始下降,由于胰島β細胞的不足。在ZDF大鼠中,心臟會發(fā)展成心肌肥大,脂類儲存增加。脂肪酸氧化比率和其基因表達在ZDF心肌中都增加,而糖類氧化,丙酮酸鹽脫氫酶流量、Glut4表達都降低。在ZDF中未觀察到SERCA2a mRNA表達的改變[11]。。

2.5 GK大鼠

在1975年,Goto等人在日本仙臺從211個Wistar大鼠中經(jīng)口服糖耐量實驗選出18個輕度糖耐量減退的大鼠,經(jīng)過10代左右反復選擇高血糖鼠交配,形成與人類Ⅱ型糖尿病近似的自發(fā)性非肥胖Ⅱ型糖尿病鼠種,稱為GK(Goto—Kakizaki Rat)大鼠。該鼠種主要表現(xiàn)為胰島β細胞分泌功能受損、空腹高血糖、肝糖原生成增多,肝臟、肌肉和脂肪組織中度胰島素抵抗等,并出現(xiàn)各種糖尿病并發(fā)癥。18月齡時GK大鼠即出現(xiàn)了血糖升高、心率降低、心肌萎縮等癥狀,與人類Ⅱ型糖尿病心臟病進展極為相似,并有顯著的心肌肥大、間質(zhì)纖維增生和持續(xù)的心肌細胞凋亡。在糖尿病中,心肌壓力響應路徑被認為是心肌重構(gòu)的一個獨立的危險因素。GK大鼠心肌梗塞所誘導的抑癌基因蛋白表達增加,Akt磷酸化減少和相伴的FOXO3a磷酸化減少可能導致了心肌細胞死亡增加,GK大鼠發(fā)生心肌梗塞后梗死區(qū)域Sirt1蛋白過度生成。這種現(xiàn)象與p53的乙?；嘘P(guān)。當p38 MAP激酶長期處于激活狀態(tài)時會促進GK大鼠心肌梗死后重建,間質(zhì)纖維化,心肌肥大以及增加前促炎因子調(diào)節(jié)器的表達[12]。也有研究發(fā)現(xiàn)糖尿病GK大鼠的毒蕈堿受體系統(tǒng)改變可能導致糖尿病膀胱病的發(fā)生[13]。

2.6 OLETF大鼠

通過對Long-Evans大鼠進行雜交,篩選超重者進行近交而成。其膽囊收縮素(CCK)-A受體mRNA的表達完全缺失,攜帶的ODB1和ODB2基因與糖尿病的發(fā)病有關(guān)。多食、少動、肥胖和出現(xiàn)糖尿病的臨床表現(xiàn)為主要特征。早期以胰島素抵抗、糖脂代謝紊亂為主,以后逐漸出現(xiàn)胰腺功能減退,晚期合并糖尿病腎臟病變,與人類2型糖尿病極為相似。有資料顯示,OLETF大鼠不僅缺乏外周的飲食飽足感信號,而且CART肽引起食欲缺乏的作用也減弱了[14]。

3 轉(zhuǎn)基因動物模型

為闡明某一單個基因在Ⅱ型糖尿病發(fā)病中的作用,人們采用基因敲出或基因過表達等手段復制出一系列Ⅱ型糖尿病動物模型,但這種但基因改變的動物模型往往與臨床具有一定的差距,其應用范圍也受到很大的限制。

3.1 SREBP-2轉(zhuǎn)基因小鼠

Ishikawa等為了研究胰島β細胞合成膽固醇的作用,使用了一種胰島β細胞SREBP-2轉(zhuǎn)基因小鼠。該研究表明SREBP-2蛋白活化導致了大量β細胞凋亡和膽固醇聚積,產(chǎn)生嚴重的糖尿病。可以用于脂毒性及膽固醇代謝與β細胞功能損傷方面的研究[15]。

3.2 MODY模型[16]

MODY(Maturity-onset diabetes of the young,MODY),即青幼年發(fā)病的成年型糖尿病,是Ⅱ型糖尿病的一個亞型,有5種蛋白質(zhì)的基因缺失或突變可以導致MODY,分別是肝細胞核因子 4α(HNF-4a/MODYl),葡萄糖激酶(GK,MODY2),肝細胞核因子 1α(HNF1a/MODY3),胰島素啟動因子(IPF-1/MODY4),肝細胞核因子 1β(HNF-1β,MODY5)。MODY2 模型是由于葡萄糖激酶基因第629位的核苷酸由T變成了G,導致了210號位蛋氨酸變成了精氨酸。由于這種突變,造成了成年突變小鼠肝臟葡萄糖激酶活性明顯的降低,但是表達葡萄糖激酶的mRNA和這種蛋白質(zhì)卻并沒有減少。純合子的突變小鼠表現(xiàn)出嚴重的生長停滯和高血糖,并在出生后不久便死亡;而雜合子突變小鼠在出生后只表現(xiàn)出輕微的血糖升高和葡萄糖不耐受及葡萄糖誘導的胰島素分泌紊亂。此外,雄性突變小鼠在90天后還表現(xiàn)出胰島敏感性和空腹血清胰島素水平降低。而純合子與雜合子突變小鼠在出生時胰島β細胞總數(shù)是相同的,但在210天后胰島細胞和β細胞容積以及單獨的β細胞容積發(fā)生了顯著性的改變,這僅在雄性突變小鼠中有所發(fā)現(xiàn)[17]。

3.3 KK-Ay小鼠

KK小鼠是日本學者培育的一種輕度肥胖的Ⅱ型糖尿病動物,將黃色肥胖基因(即Ay)轉(zhuǎn)至KK小鼠,得KK-Ay小鼠。與KK小鼠相比,KK-Ay小鼠有明顯的肥胖和糖尿病癥狀。具有高血糖、高胰島素血癥、胰島素抵抗、糖耐量受損、過量飲食等癥狀。2月齡時開始出現(xiàn)中度肥胖,4～5月齡時進入穩(wěn)定期,脂肪約占總體重量的33%;并逐漸出現(xiàn)角膜退化、皮膚上皮細胞壞死等癥狀;15周齡時還會出現(xiàn)心肌間質(zhì)纖維化;后期的腎小球系膜細胞增殖和細胞外基質(zhì)積聚會進一步惡化形成糖尿病腎病。KK-Ay12周齡以后的尿蛋白、血肌酐、體重、隨機血糖、空腹血糖、血紅蛋白、血壓、終末糖基化產(chǎn)物和轉(zhuǎn)化生長因子-β等指標均明顯高于其對照組 BALB/c小鼠,出現(xiàn)典型的Ⅱ型糖尿病癥狀[18]。KK-Ay小鼠的糖尿、體重、空腹血糖水平與基因Guq1和Guq2有著復雜的關(guān)聯(lián)。其糖耐量和血清胰島素則隨著年齡的增加而惡化[19]。

4 總結(jié)

一種良好的動物模型必須具備以下條件：穩(wěn)定可靠,易于重復;經(jīng)濟易得;復制成功所需時間短,其主要表現(xiàn)與臨床表現(xiàn)相似。綜上所述,目前各種Ⅱ型糖尿病模型有其各自的優(yōu)缺點,如：誘導性動物模型價格低廉,可操作性強,但與臨床實際情況相差較遠,常影響到研究結(jié)果的可靠性;自發(fā)性動物模型的發(fā)病機制、病理變化以及臨床表現(xiàn)與人類Ⅱ型糖尿病的發(fā)病機制相似,但其價格較貴,飼養(yǎng)條件要求嚴格,周期長,使其應用受到了極大的限制;而轉(zhuǎn)基因動物模型多為單一基因的敲除或過表達,其針對性較強,是探討個別基因在糖尿病發(fā)病中的作用和地位的最佳選擇,但制作技術(shù)難度較高,目前在國內(nèi)外應用均受到了一定的限制。因此,復制一種周期短、與人類發(fā)病機制相似的Ⅱ型糖尿病動物模型是研制、開發(fā)防治Ⅱ型糖尿病及其并發(fā)癥藥物急需解決的難題。

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