溶菌酶和抗生素對肉雞組織IGF-ⅠmRNA的影響

武漢新華揚生物股份有限公司 程時軍 張 偉

華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物營養(yǎng)系 馬立保*

胰島素樣生長因子-Ⅰ（IGF-Ⅰ）是機體發(fā)育中必不可少的生長激素（Daughaday和Rotwein，1989）。研究表明，IGF-Ⅰ主要由肝臟合成分泌，其在畜禽血液中的含量與體增重呈正相關(guān)（Beccavin等，2001），是促進肉雞生長的主要因子（Frank 等，1998）。 Hathaway 等（1996）報道，飼喂抗生素可使畜禽血清中的IGF-Ⅰ含量增加，從而促進畜禽生長。本試驗以溶菌酶替代抗生素使用，探討溶菌酶對肉雞體組織IGF-ⅠmRNA表達的影響，并簡要探討了溶菌酶可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 1日齡艾維因肉雞144只，購自武漢正大有限公司。

溶菌酶酶活性為500000 U/g，由武漢某公司提供，其酶活單位定義為：在25℃、pH為6.2的條件下，于450 nm處每分鐘引起溶酶小球菌體溶液吸光度下降0.001為1個酶活力單位（U）。

1.2 主要儀器及試劑 儀器：超凈工作臺（北京東聯(lián)哈爾儀器有限公司）、組織樣本破碎機（Fast-Prep-24）、離心機（eppendorf centrifuge 5415R）、基因擴增儀（東勝創(chuàng)新EDC-810）、電泳儀（北京六一儀器廠DYY-7C型）、成像系統(tǒng)（AlphaImager EP）及實時 PCR 系統(tǒng)（Applied Biosystems 7500）。

試劑：TRIzol試劑、脫氧核（糖核）苷、DNA 多聚酶、AMV反轉(zhuǎn)錄酶、核糖核酸分解酶抑制劑、緩沖液、隨機引物，熒光定量PCR試劑盒（SYBR green，含ROX內(nèi)參染料）。

1.3 試驗設(shè)計 采用單因子試驗設(shè)計，分4個處理組：（1）對照組，飼喂不含抗生素的基礎(chǔ)日糧；（2）抗生素組，飼喂含抗生素（有效成分為桿菌肽鋅和硫酸粘桿菌素，在日糧中的含量分別為20 mg/kg和4 mg/kg）的基礎(chǔ)日糧；（3）溶菌酶組1，飼喂含溶菌酶 150 mg/kg的基礎(chǔ)日糧；（4）溶菌酶組2，飼喂含溶菌酶300 mg/kg的基礎(chǔ)日糧。每組6重復(fù)，每重復(fù)6只，公母各半。試驗日糧參照NY/T 33-2004配制玉米-豆粕型粉料，各階段基礎(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)水平

1.4 飼養(yǎng)管理 試驗于2008年11月20日至12月31日在湖北省飼料檢測站動物試驗房內(nèi)進行，分0～21 d和22～42 d兩階段地面平養(yǎng)；室內(nèi)溫度按飼養(yǎng)標準控制；在2～3周齡時以地克珠利飲水防球蟲病。免疫程序為：7 d用新城疫Lasota+傳染性支氣管炎H120二聯(lián)苗滴鼻、點眼；分別于14 d和21 d時IBD飲水。

1.5 樣品收集及處理 于42日齡清晨從各處理中隨機選取6只雞（每重復(fù)1只），翅靜脈采血，再屠宰取肝臟及一側(cè)胸肌各5 g左右用錫箔紙包好編號迅速置入液氮灌冷凍，轉(zhuǎn)到-80℃冰箱保存待用。

1.6 檢測指標及方法

1.6.1 RNA的提取 取適量組織于研缽加液氮研磨，再取 100 μL 研磨液，加入 500 μL TRIzol，室溫放置10 min，加入 100 μL氯仿，并劇烈振蕩5 s，室溫放置5 min。12000 r/min低溫離心15 min，取上清 200 μL，加 200 μL 異丙醇，冰盒上放置15 min。12000 r/min低溫離心10 min，沉淀用75%乙醇洗滌1次，低溫離心（8000 r/min，8 min）后棄上清液，風(fēng)干后沉淀用DEPC水溶解，-80℃保存?zhèn)溆没蛄⒓催M行反轉(zhuǎn)錄。

1.6.2 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系見表2。反應(yīng)程序：30 ℃ 10 min，42 ℃ 40 min，99 ℃ 5 min，1個循環(huán)，4℃結(jié)束。產(chǎn)物-20℃保存?zhèn)溆没蛄⒓催M行RT-qPCR。

表2 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系（10 μL）

1.6.3 引物設(shè)計、合成和檢測 本試驗用內(nèi)參基因β-actin的引物參照馬莉等（2007）方法，用Primer-BLAST為IGF-Ⅰ設(shè)計引物，序列見表3。

表3 試驗用引物序列

1.6.4 熒光定量PCR反應(yīng) 反應(yīng)體系總體積為20 μL，待檢樣品和內(nèi)參基因樣品均參照表4的反應(yīng)體系進行。反應(yīng)程序：95℃2 min，1個循環(huán)，然后95 ℃ 15 s，56 ℃ 30 s，68 ℃ 45 s，35 個循環(huán)。1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 試驗數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標準差表示，采用SPSS 16.0軟件進行ONE-WAYANOVA分析，并以LSD作多重比較。

表4 熒光定量PCR反應(yīng)體系（20 μL）

2 結(jié)果與分析

溶菌酶對42 d肉雞肝臟和胸肌IGF-ⅠmRNA的影響結(jié)果見表5。

表5 溶菌酶對42日齡肉雞肝臟和胸肌IGF-ⅠmRNA的影響

從表5可以看出，抗生素組較對照組肝臟IGF-Ⅰ mRNA水平顯著提高了 18.8%（P＜0.05），2個溶菌酶組也較對照組分別提高12.5%和10.4%；2個溶菌酶組及抗生素組間差異不顯著（P＞0.05）；抗生素和2個溶菌酶組胸肌IGF-ⅠmRNA水平較對照組有提高的趨勢，但無顯著差異（P ＞ 0.05）。

3 討論

IGF-Ⅰ可以通過旁分泌及自分泌來參與促進機體的生長發(fā)育、營養(yǎng)代謝及肌細胞分化（Perrone，1995；Widmer 等 ，1985；Schmid 等 ，1983）。Beccavin等（2001）發(fā)現(xiàn)雞的生長速度與肝臟IGF-ⅠmRNA和血液IGF-Ⅰ水平相關(guān)。Duclos（2005）通過遺傳學(xué)和營養(yǎng)模型綜合分析得出的數(shù)據(jù)表明，決定旁分泌的IGF-Ⅰ水平的肌肉IGF-ⅠmRNA豐度和出生后雞的肌肉生長正相關(guān)。本試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，抗生素組、溶菌酶組1和溶菌酶組2可將肝臟IGF-Ⅰ mRNA水 平 分別 提 高 18.8%（P ＜ 0.05）、12.5%（P ＞0.05）和 10.4%（P ＞ 0.05），抗生素組和 2個溶菌酶組胸肌IGF-ⅠmRNA水平有提高的趨勢，但無顯著差異（P ＞ 0.05），這與 Beccavin 等（2001）及Duclos（2005）的研究結(jié)果類似。Hathaway等（1996）給斷奶豬飼喂抗生素ASP-250（四環(huán)素、磺胺甲嘧啶和青霉素的混合物）發(fā)現(xiàn)，血清IGF-Ⅰ濃度顯著高于對照組（P＜0.001），血清IGF-Ⅰ濃度提高24.8%的同時豬平均日增重提高26%，血清IGF-Ⅰ的受體IGFBP-3含量增加59%，推測使用抗生素影響IGF-Ⅰ從而促進豬生長。本試驗雖未檢測抗生素對IGF-Ⅰ及其受體含量的影響，但結(jié)果發(fā)現(xiàn)抗生素較對照組可顯著提高肉雞肝臟IGF-ⅠmRNA水平（P＜0.05），與上述報道類似。

另有報道稱肝臟IGF-Ⅰ基因受到生長激素（GH）、日糧能量及蛋白質(zhì)濃度等因素調(diào)節(jié)（VandeHaar 等 ，1991；Emler 和 Schalch，1987；Roberts等，1986）。本試驗結(jié)果證明，除上述因素外，抗生素類物質(zhì)也可影響肝臟IGF-Ⅰ基因表達，這也可能是其促生長機制之一。但溶菌酶是直接導(dǎo)致IGF-Ⅰ基因表達的提高，還是通過其他途徑間接導(dǎo)致IGF-Ⅰ基因表達改變從而影響動物生長后，具體作用機制還有待深入研究。

4 小結(jié)

日糧中添加150 mg/kg和300 mg/kg的溶菌酶可將42日齡肉雞肝臟IGF-ⅠmRNA水平較對照組分別提高12.5%和10.4%，但與對照組及抗生素組比較差異不顯著（P＞0.05）；其對胸肌IGF-ⅠmRNA水平也有提高趨勢（P＞0.05）。

[1]馬莉，謝秀蘭，岳華.雞β-actin基因?qū)崟r熒光定量PCR方法的建立[J].中國畜牧獸醫(yī)，2007，34：2.

[2]中華人民共和國農(nóng)業(yè)部.NY/T 33-2004，中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標準——雞飼養(yǎng)標準[S].2004-08-25.

[3]Beccavin C，Chevalier B，Cogburn1 L A，et al.Insulin-like growth factors and body growth in chickens divergently selected for high or low growth rate[J].Journal of Endocrinology，2001，168：297 ～306.

[4]Daughaday W H，Rotwein P.Insulin-like growth factorsⅠ andⅡ：peptide，messenger ribonucleic acid and gene structures，serum，and tissue concentrations[J].Endocr Rev，1989，10：68 ～91.

[5]Duclos M J.Insulin-like growth factor-Ⅰ（IGF-Ⅰ）mRNA levels and chicken muscle growth[J].Journal of Physiology and Pharmacology，2005，56（3）：25 ～35.

[6]Emler C A，Schalch D S.Nutritionally-induced changes in hepatic insulinlike growth factor-Ⅰ（IGF-Ⅰ）gene expression in rats[J].Endocrinology，1987，120：832.

[7]Frank M T，Robert A P，John P M，et al.Francis.Insulin-like Growth Factor（IGF）-Ⅰ but Not IGF-Ⅱ Promotes Lean Growth and Feed Efficiency in Broiler Chickens[J].General and Comparative Endocrinology，1998，110：262～275.

[8]Hathaway M R，Dayton W R，White M E，et al.Serum insulin-like growth factorⅠ（IGF-Ⅰ）concentrations are increased in pigs fed antimicrobials[J].J Anim Sci，1996，74：1541 ～1547.

[9]Perrone C E，F(xiàn)enwick-Smith D，Vandenburgh H H.Collagen and stretch modulate autocrine secretion of insulin-like growth factor-Ⅰand insulinlike growth factor binding proteins from differentiated skeletal muscle cells[J].J Biol Chem，1995，270：2099 ～2106.

[10]Roberts C T Jr，Brown A L，Graham D E，et al.Growth hormone regulates the abundance of insulin-like growth factor-ⅠmRNA in adult rat liver[J].J Biol Chem，1986，261：10025.

[11]Schmid C H，Steiner T H，F(xiàn)roesch E R.Preferential enhancement of myoblast differentiation by insulin-like growth factors（IGFⅠ and IGFⅡ）in primary cultures of chicken embryonic cells[J].FEBS Lett，1983，161：117 ～121.

[12]VandeHaar M J，Moats-Staats B M，Davenport M L，et al.Reduced serum concentrations of insulin-like growth factor-Ⅰ（IGF-Ⅰ）in proteinrestricted rats are accompanied by reduced IGF-ⅠmRNA levels in liver and skeletal muscle[J].J Endocrinol，1991，130：305.

[13]Widmer U，Schmid C H，Zapf J，et al.Effects of insulin-like growth factors on chick embryo hepatocytes[J].Acta Endocrinol，1985，108：237 ～244.